发芽糙米提取物抗氧化性及活性成分分析

刘晓飞，侯艳，马京求，戚月娜，赵小红，张娜

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨150028）

糙米在水分充足、光照适当的环境下，便可萌芽。萌芽使糙米内部大量的酶被唤醒释放，并在萌芽过程中营养素由结合态变为游离态[1]，萌芽后的糙米包含的营养成分较萌芽前有所提高[2]，还会产生大量的γ-氨基丁酸[3]，γ-氨基丁酸可以缓解动脉硬化以及改善肝功能等[4]。同时，发芽糙米内部还具有多种抗氧化活性物质，如多酚类物质、黄酮类物质、多糖、糖蛋白[5]等。目前，水、有机溶剂以及有机溶剂与水等的混合体系被广泛应用于提取多酚等抗氧化物质[6]，因此可选择水、甲醇、乙醇、丙酮等溶剂提取多酚类物质，这些溶剂亦可有效提取黄酮类物质。李婧雯等[7]采用不同极性的6种溶剂对蒲公英进行提取，水提取物中多糖含量最高，乙醇的提取物中总黄酮和总酚含量是最高的，甲醇的提取物中皂苷含量最高。崔泰花等[8]采用不同极性的8种溶剂对桔梗进行提取，结果显示总酚在蒸馏水提取物中含量最高，石油醚的提取物中总黄酮、麦角甾醇含量是最高的，乙醇的提取物中去芹糖桔梗皂苷D含量是最高的，桔梗皂苷D仅在蒸馏水提取物中检出。

本试验分别以蒸馏水、甲醇、无水乙醇、丙酮、石油醚制备发芽糙米提取物，采用DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率和铁离子还原能力为指标进行抗氧化活性评价，并测定各发芽糙米提取物中总酚、总黄酮、γ-氨基丁酸、糖蛋白和多糖含量，并考察其对抗氧化活性的影响。对发芽糙米活性功能评估及开发应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糙米：黑龙江省农业科学院；甲醇、无水乙醇、丙酮、石油醚、抗坏血酸、氢氧化钠、浓硫酸、硝酸铝、无水碳酸钠（分析纯）：南京生物化学试剂研究中心。

1.2 仪器与设备

M288479高速万能粉碎机：北京东方德教育科技有限公司；SHZ-B水浴恒温振荡器：天津市泰斯特仪器仪表有限公司；TGL-16G-B台式高速离心机：闽南星科科学仪器厂；RE-301旋转蒸发器：上海保玲仪器设备有限公司；721E紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 待测样品的提取

1.3.1.1 糙米发芽

选用胚完好且完整的糙米，用0.1 mol/L次氯酸钠溶液浸泡1 h，用冷却的开水清洗3次，4℃避光的条件下，将糙米浸泡在无菌水中12 h。取出糙米后放置在潮湿的环境中在20℃条件下培养过夜。去除掉没有发芽的糙米后置于干燥箱内干燥[9]。

1.3.1.2 发芽糙米提取物的制备

将干燥好的发芽糙米粉碎，过80目筛。精确称量5.0 g发芽糙米粉5份，按照1∶20(g/mL)料液比分别与蒸馏水、甲醇、无水乙醇、丙酮和石油醚混合，65℃水浴振荡90 min，4 200 r/min离心10 min，沉淀物按相同条件再提取1次，合并上清液、过滤、相应溶剂定容、蒸发浓缩，得到最终提取物。将经不同极性溶剂提取的发芽糙米提取物分别稀释 0、2.5、5.0、7.5、10.0 倍，备用。

1.3.2 DPPH自由基清除率测定

取不同稀释倍数的各提取物0.5 mL，添加0.1 mmol/L DPPH溶液（取0.039 4 g DPPH溶于1 L无水乙醇中）2.5 mL，室温25℃放置于避光处。空白对照为无水乙醇，阳性对照为抗坏血酸[10]。517 nm处测吸光度值。计算公式如下。

式中：E1为DPPH自由基清除率，%；A0为空白组吸光度值；A1为待测样品吸光度值。

1.3.3 超氧阴离子自由基清除率测定

取不同稀释倍数的各提取物0.1 mL，添加0.1 mol/L pH 8.2 的三羟甲基氨基甲烷（tromethamine，Tris）缓冲溶液2.8 mL，混匀。25℃水浴10 min，加入3 mmol/L没食子酚溶液0.1 mL，每30 s于325 nm波长处测定一次吸光度值，连续测定5 min，记录数据，绘制其回归方程，空白对照为蒸馏水，阳性对照为抗坏血酸[11]。计算公式如下。

式中：E2为超氧阴离子自由基清除率，%；Va为蒸馏水斜率；Vb为样品斜率。

1.3.4 羟基自由基清除率测定

0.75 mmol/L的邻二氮菲无水乙醇溶液1.0 mL，依次添加pH 7.4 0.2 mol/L磷酸缓冲液2.0 mL、不同稀释倍数各提取物1 mL，充分振荡。再添加1.0 mL 0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液，振荡均匀，最后添加1.0 mL 1%的过氧化氢溶液。37℃水浴1 h，510 nm测吸光度值，空白对照为蒸馏水，阳性对照为抗坏血酸[12]。计算公式如下。

式中：E3为羟基自由基清除率，%；A为蒸馏水替代样品的吸光度；B为样品反应后的吸光度；C为蒸馏水代替H2O2的吸光度。

1.3.5 铁离子还原能力测定

取不同稀释倍数的各提取物2.0 mL，添加0.2 mol/L pH 6.6磷酸缓冲溶液2.0 mL，1%铁氰化钾溶液2.0 mL。50℃水浴20 min，添加2.0 mL 10%三氯乙酸溶液，振荡，3 000 r/min离心5 min，取上清液2.0 mL，依次加入0.1%的三氯化铁溶液0.4 mL，蒸馏水2 mL，50℃水浴10 min；当溶液由黄变蓝时，700 nm处对其吸光度值进行测定，空白对照为蒸馏水，阳性对照为抗坏血酸[13]。

1.3.6 总酚含量的测定

采用Folin-Ciocalteu法测定各提取物中的总酚含量[14]。精准称取没食子酸标准样品10.0 mg，用50%甲醇配成2.5 mg/mL标准液。准确吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL标准液于试管，50%甲醇定容至1.0 mL。吸取不同浓度的标准液各0.1 mL，加入50%的Folin-Ciocalteu试剂1.0 mL，充分振荡1.0 min后加入0.2 g/L的碳酸钠溶液2.0 mL，再添加蒸馏水至5.0 mL，充分混匀后在避光室温25℃条件下放置2.0 h，于760 nm测其吸光度值。记录数据，绘制标准曲线。得到没食子酸标准曲线的回归方程为y=1.458 4x+0.021 3，R2=0.997 7。

取不同稀释倍数的各提取物0.1 mL，按照上述方法测定其吸光度值，以没食子酸为当量计算各提取物中总酚含量。

1.3.7 总黄酮含量的测定

采用亚硝酸钠-硝酸铝法测定各提取物中的总黄酮含量[15]。精准称量芦丁标准样品17.5 mg，用50%甲醇配制成2.5 mg/mL标准液。准确吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL标准液移入试管，添加5%亚硝酸钠溶液0.15 mL、再添加10%硝酸铝溶液0.15 mL，分别静置6 min，加入2 mL 4%氢氧化钠溶液，添加蒸馏水至5.0 mL，待测液混匀后放置3 min，于508 nm处测定吸光度值。记录数据，绘制标准曲线。得到芦丁标准曲线的回归方程为y=12.051x-0.007 1，R2=0.997 7。

取不同稀释倍数的不同极性溶剂提取液0.5 mL，按照上述方法测定其吸光度，以芦丁为当量计算各提取物中总黄酮含量。

1.3.8 γ-氨基丁酸含量的测定

采用比色法测定各提取物中的γ-氨基丁酸含量[16]。准确配制 0.04、0.10、0.25、0.50、1.00 mg/mL 的 γ-氨基丁酸标准溶液，加入0.1 mol/L四硼酸钠缓冲液0.8 mL，6%重蒸苯酚液2.0 mL，混匀后添加1.0 mL 7.5%的次氯酸钠溶液，充分振荡。沸水浴10 min，随即冰浴5 min，待溶液显现蓝绿色，随即添加2.0 mL 60%乙醇溶液，于645 nm处测定其吸光度值。记录数据，绘制标准曲线。得到γ-氨基丁酸的标准曲线的回归方程为 y=0.907 7x-0.011，R2=0.999 2。

取不同稀释倍数的各提取物1.0 mL，按照上述方法测定吸光度，计算各提取物中γ-氨基丁酸含量。

1.3.9 糖蛋白含量的测定

采用考马斯亮蓝检测法分析各提取物中的糖蛋白含量。配制1.0 mg/mL的牛血清白蛋白标准溶液，分别吸取 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0 mL 用蒸馏水定容至100 mL，吸取稀释液各1.0 mL，添加5.0 mL考马斯亮蓝溶液，振荡后静置2 min，在595 nm测其吸光度，空白对照为蒸馏水。记录数据，绘制标准曲线。得到牛血清白蛋白标准曲线的回归方程为y=0.077 9x+0.083 1，R2=0.992 4。

取不同稀释倍数的不同极性溶剂提取液1.0 mL，按上述方法测其吸光度，计算各提取物中糖蛋白含量。

1.3.10 多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸检测法分析各提取物中的多糖含量。精确配制1.0 mg/mL葡萄糖溶液100 mL，精确吸取10 mL，蒸馏水定容到250 mL，即为葡萄糖标准液，分别移取 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，用蒸馏水定容到2.0mL，添加1.0mL6%苯酚溶液、5.0mL浓硫酸。充分振荡，25℃冷却20 min，490 nm测其吸光度，空白对照为蒸馏水。记录数据，绘制标准曲线。得到葡萄糖标准曲线的回归方程为y=0.328 0x-0.018 5，R2=0.994 4。

取不同稀释倍数的各提取物1.0 mL，按照上述方法测其吸光度，计算各提取物中多糖含量。

2 结果与分析

2.1 DPPH自由基清除能力

不同极性溶剂发芽糙米提取物的DPPH自由基清除率如图1所示。

图1 不同极性溶剂提取物对DPPH自由基清除率的影响Fig.1 Effects of different polar solvent extracts on DPPH free radical scavenging rate

由图1可知，不同极性溶剂发芽糙米提取物对DPPH自由基的清除率均小于抗坏血酸，但相差不大。随着提取物稀释倍数的增大，溶液内的抗氧化活性物质含量越少，因此所有提取物对DPPH自由基清除能力均变弱。整体上各提取物对DPPH自由基的清除能力大小依次为蒸馏水>丙酮>无水乙醇>甲醇>石油醚。李现日等[17]发现：当金花葵花提取物的浓度相同时，不同的极性溶剂提取物DPPH自由基清除能力顺序依次为正丁醇＞无水乙醇＞石油醚＞水。这几种溶剂的极性强弱为水>甲醇>无水乙醇>丙酮>正丁醇>石油醚，由此可知提取溶剂的极性对提取物的DPPH自由基清除能力并无太大的影响。而Sepahpour等[18]研究姜黄、咖喱叶和火炬姜柠檬草发现，蒸馏水提取物的抗氧化能力低于其它极性溶剂提取物，这与本试验结果差异较大，可能是蒸馏水更适于发芽糙米中抗氧化物质的提取。

2.2 超氧阴离子自由基清除能力

不同极性溶剂发芽糙米提取物对超氧阴离子自由基清除率的影响如图2所示。

图2 不同极性溶剂提取物对超氧阴离子自由基清除率的影响Fig.2 Effects of different of polar solvent extracts on superoxide anion radical scavenging rate

由图2可知，不同极性溶剂发芽糙米提取物对超氧阴离子自由基的清除率均低于抗坏血酸，且相差较大。其中蒸馏水提取物与无水乙醇提取物的清除率随提取物稀释倍数的增加呈陡峭性下降趋势，而甲醇提取物的清除效果一直比其它极性溶剂提取物差，且随提取物稀释倍数的增大呈平缓型下降趋势。随着提取物稀释倍数的增大，所有提取物超氧阴离子自由基清除率均下降。此现象的出现，可能是由于极性溶剂浓度对发芽糙米中抗氧化物质的提取量有影响。整体上各提取物超氧阴离子自由基清除能力强弱顺序为无水乙醇>丙酮>石油醚>蒸馏水>甲醇。郭刚军等[19]发现不同溶剂普洱茶的提取物对超氧阴离子自由基清除的能力强弱依次为抗坏血酸>水>正丁醇>氯仿>乙醇，而几种溶剂的极性强弱为水>甲醇>乙醇>丙酮>正丁醇>氯仿>石油醚，可见提取溶剂的极性对提取物清除超氧阴离子自由基的能力无太大影响。而与本试验结果的差别可能是由于被提取物不同，且提取出的抗氧化活性物质的种类及含量不同。

2.3 羟基自由基清除能力

不同极性溶剂发芽糙米提取物对羟基自由基清除能力的影响如图3所示。

图3 不同极性溶剂提取物对羟自由基清除率的影响Fig.3 Effects of different polar solvent extracts on hydroxyl radical scavenging rate

由图3可知，不同极性溶剂发芽糙米提取物对羟基清除率均小于抗坏血酸，且相差较大。其中蒸馏水提取物的清除率随提取物稀释倍数增大呈陡峭性下降趋势，而其它溶剂提取物的清除率随提取物稀释倍数增大而呈平缓性下降趋势。甲醇提取物的清除率与丙酮提取物相差不大，但均小于其它提取物。随着提取物稀释倍数的增大，所有提取物的羟基自由基清除效果均变弱，可见各提取物的羟基自由基清除率受溶液浓度影响较大。同时，由于极性不同的溶剂从发芽糙米中提取出的抗氧化物质数量也有区别，自由基的清除率也可能受此影响。各提取物对羟基自由基的清除率依次为蒸馏水>石油醚>无水乙醇>甲醇>丙酮。云成悦等[20]发现不同极性溶剂头花蓼多酚的提取物对羟基自由基清除率的大小为水>石油醚>氯仿>正丁醇>乙酸乙酯，而溶剂的极性强弱为水>甲醇>乙醇>丙酮>正丁醇>乙酸乙酯>氯仿>石油醚，可知提取溶剂的极性对发芽糙米提取物的羟基自由基清除能力并无太大影响。而本试验结果顺序与之并不一致，可能是因为不同的物质本身所含有的抗氧化活性物质的种类以及含量不同。

2.4 铁离子还原能力

不同极性溶剂发芽糙米提取物对铁离子还原能力的影响如图4所示。

由图4可知，不同极性溶剂发芽糙米提取物对铁离子的还原能力均弱于抗坏血酸，且相差较大。蒸馏水提取物与甲醇提取物对铁离子的还原能力随提取物稀释倍数的增加呈平缓性下降趋势，其余提取物下降幅度更为平缓。因此各提取物对铁离子的还原能力受溶液溶度的影响极大。Mehral等[21]也有类似的发现。无水乙醇提取物与丙酮提取物的铁离子还原能力相差不大，但随着提取溶液稀释倍数的增加，丙酮提取物受浓度的影响比无水乙醇提取物大。整体上不同极性溶剂的发芽糙米提取物还原铁离子能力的强弱依次为蒸馏水>甲醇>无水乙>丙酮>石油醚。曹清华等[22]发现经不同极性溶剂提取的白术提取物铁离子还原能力排序依次为抗坏血酸>乙酸乙酯>正丁醇>石油醚>水，溶剂的极性顺序为水>甲醇>乙醇>丙酮>正丁醇>乙酸乙酯>石油醚，由此可以发现溶液的极性对发芽糙米提取物的铁离子还原能力并无太大的影响。而本试验结果顺序与之不一致，可能是提取方式不一致，也可能是不同物质本身所含的抗氧化活性物质有所不同。

图4 不同极性溶剂提取物对铁离子还原能力的影响Fig.4 Effects of different of polar solvent extracts on iron ion reduction ability

2.5 不同溶剂提取物中活性物质分析

2.5.1 蒸馏水提取物中活性物质分析

蒸馏水提取物中各活性物质含量如图5所示。

图5 蒸馏水提取物中各物质含量Fig.5 Contents of each substance in distilled water extract

从图5可以得到，发芽糙米蒸馏水提取物中各物质含量大小的排序为糖蛋白＞多糖＞γ-氨基丁酸＞总黄酮＞总酚。可以发现蒸馏水适合用于发芽糙米内部糖蛋白的提取。结合图1、图3、图4结果，与其它极性溶剂提取物相比，蒸馏水提取物具有较高的DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力和铁离子还原能力。可推测蒸馏水提取物中的糖蛋白与多糖起着主要的抗氧化作用，而γ-氨基丁酸、总酚和总黄酮起到的作用则较小。涂宗财等[23]采用不同极性的溶剂提取红薯叶中的总酚，发现水提液具有最高的总酚得率。董怡等[24]研究溪黄草根的不同极性溶剂提取物中的总酚含量，发现总酚含量最高的为60%乙醇的提取物，而总酚含量最低的为水的提取物。由此可以发现，不同植物经不同极性溶剂提取的提取物中总酚含量最高的不都是水提取物，造成此现象的原因可能是不同植物本身的性质有较大的差别。

2.5.2 甲醇提取物中活性物质分析

甲醇提取物中各活性物质含量如图6所示。

图6 甲醇提取物中各物质含量Fig.6 Contents of each substance in methanol extract

由图6可知，发芽糙米甲醇提取物中各物质的含量大小排序为多糖＞糖蛋白＞总黄酮＞γ-氨基丁酸＞总酚。由前面试验结果可知，甲醇提取物对铁离子的还原能力仅次于蒸馏水提取物，在甲醇提取物中对铁离子还原起主要作用的物质是多糖，其次是糖蛋白、γ-氨基丁酸、总黄酮以及总酚。刘晓飞等[25]发现发芽糙米内部的多糖具有良好的抗氧化效果和总还原能力。由此可知，多糖具有较好的抗氧化效果。而大量研究表明[26]总酚和总黄酮是抗氧化活性的物质基础，多酚及总黄酮含量较多的样品显示出更好的抗氧化能力。由于甲醇提取物中总酚及总黄酮的含量较少，所以未在甲醇提取物的抗氧化能力上起到作用。由图6还可以发现甲醇适合发芽糙米中多糖的提取，可以从发芽糙米中提取多糖，作为天然的抗氧化剂用来延缓人体的衰老或者是其它的不良症状。

2.5.3 无水乙醇提取物中活性物质分析

无水乙醇提取物中各活性物质含量如图7所示。

由图7可以得到，发芽糙米无水乙醇提取物中各物质含量大小的排序为糖蛋白＞多糖＞γ-氨基丁酸＞总黄酮＞总酚。可以发现无水乙醇适合发芽糙米中糖蛋白的提取。由前面试验结果可知，与其它提取物相比，无水乙醇提取物对超氧阴离子自由基具有最强的清除作用，提取物中的糖蛋白在超氧阴离子自由基的清除中起主要作用，多糖起次要作用，γ-氨基丁酸、总黄酮和总酚起到的作用较小。而韩璐等[27]发现焙烤发芽糙米中的黄酮具有较强的铁离子还原能力。Paula等[28]发现物质提取的产率取决于所用的溶剂，随极性、pH值、温度、提取时间和样品的组成而变化。所以造成上述现象出现的原因可能是提取时间以及提取温度等使发芽糙米中总黄酮的含量发生了改变，从而导致提取到的总黄酮含量较低。

图7 无水乙醇提取物中各物质含量Fig.7 Content of each substance in anhydrous ethanol extract

2.5.4 丙酮提取物中活性物质分析

丙酮提取物中各活性物质的含量如图8所示。

图8 丙酮提取物中各物质含量Fig.8 Content of each substance in acetone extract

由图8可以得到，发芽糙米的丙酮提取物中各物质含量大小的排序为多糖＞γ-氨基丁酸＞糖蛋白＞总黄酮＞总酚。可知在丙酮提取物中起最主要抗氧化作用的物质是多糖，其次是γ-氨基丁酸，而糖蛋白、总黄酮和总酚起到的作用较小。丙酮提取物是除无水乙醇提取物外对超氧阴离子自由基具有较强清除能力的提取物，可推测多糖对超氧阴离子自由基具有较好的清除效果。同时还可以发现丙酮也较适宜于发芽糙米中多糖的提取。而卓玛次力[29]发现青稞发芽糙米中的γ-氨基丁酸具有极强的DPPH自由基清除能力。由此可以得出γ-氨基丁酸不仅对超氧阴离子自由基具有较好的清除能力，对DPPH自由基也具有较好的清除作用。

2.5.5 石油醚提取物中活性物质分析

石油醚提取物中各活性物质的含量如图9所示。

图9 石油醚提取物中各物质含量Fig.9 Content of various substances in petroleum ether extract

由图9可以得到，发芽糙米石油醚提取物中各物质含量大小的排序为糖蛋白＞多糖＞γ-氨基丁酸＞总酚＞总黄酮。因此在石油醚提取物中起最主要抗氧化作用的物质是糖蛋白，其次是多糖，而γ-氨基丁酸、总黄酮和总酚起到的作用较小。石油醚提取物是除蒸馏水提取物外对羟基自由基具有较强清除效果的提取物，所以糖蛋白对羟基自由基具有较好的清除能力。同时还可以发现石油醚也较适宜于发芽糙米中糖蛋白的提取。刘晓飞等[5]发现发芽糙米内的糖蛋白对DPPH自由基、羟基自由基的清除作用与抗坏血酸基本没有差异，但超氧阴离子自由基清除能力和总还原能力弱于抗坏血酸。二者之间结果有所差异，这可能是由于发芽糙米中糖蛋白的提取方法存在差异，也可能是由于溶液极性的不同影响其抗氧化活性。

3 结论

本研究的结果表明，不同的极性溶剂发芽糙米提取物均具有一定的抗氧化活性，且呈一定的量效关系，但溶液的极性对提取物的抗氧化作用无太大的影响，更重要的是不同极性溶剂提取物的抗氧化能力的大小顺序也会随评价方法的不同而呈现出差异。发芽糙米的蒸馏水提取物对DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率和铁离子还原能力较高，而无水乙醇提取物对超氧阴离子自由基清除能力较高。

本研究也测定了发芽糙米不同极性溶剂提取物中总酚、总黄酮、γ-氨基丁酸、糖蛋白和多糖的含量，分析了各种物质的含量对其抗氧化能力产生的影响。结果表明发芽糙米的蒸馏水提取物、无水乙醇提取物和石油醚提取物中的糖蛋白含量最高，发芽糙米的甲醇提取物和丙酮提取物中多糖含量最高，除石油醚提取物中为黄酮含量最低之外，其余的不同极性溶剂的发芽糙米提取物中含量最低的均为总酚。所以发芽糙米不同溶剂提取物中多糖和糖蛋白对自由基清除活性和铁离子还原能力均具有较大的影响。