时间分辨荧光分析技术在食品污染物检测中的应用进展

孙坤秀，胡志刚，成玉梁，于航，谢云飞，姚卫蓉，郭亚辉*，钱和

（1.江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214000；2．无锡市儿童医院医学检验科，江苏无锡214000）

荧光分析是一种利用物质受到光照射而发射荧光的特性对物质进行定性或定量分析的方法。荧光测量可大体分为稳态光谱测量和时间分辨光谱测量。稳态光谱测量是采用时间尺度较长的连续光源激发样品并连续收集样品发射出的荧光信号；时间分辨荧光分析技术（time-resolved fluorescence analysis，TRFA）是用时间尺度很短的脉冲光照射并利用高速检测设备反复收集样品发出的单电子荧光信号，得到荧光衰减谱，因此稳态光谱测量从概念上可以看作是时间分辨荧光在一定时间内的叠加[1]。而且稳态光谱由于荧光强度的衰减，激发光源需要持续照射荧光物质，并且需要使用单色器来屏蔽激发光和杂散光等；而TRFA使用镧系螯合物，利用这类荧光物质的荧光寿命长及斯托克斯（Stokes）位移大的特点，通过波长和时间两种分辨，有效排除了非特异性荧光信号的干扰，具有灵敏度高、稳定性好、标准曲线线性范围宽等优点，目前TRFA是最有发展前途的超微量检测分析技术[2]。

1 TRFA的原理及特点

1.1 TRFA技术原理

TRFA是一种以镧系元素及其复合物（如掺杂无机材料、螯合物等）作为荧光标记物（代替荧光物质、同位素或酶），建立的一种新型的非放射性微量荧光分析技术。该技术利用镧系元素标记信号分子，用时间分辨技术同时对波长和时间两个参数进行信号分辨，以实现高灵敏分析测定[3]。镧系稀土金属离子螯合物有很长的荧光寿命（微秒级），有别于传统荧光的短荧光寿命，使其能通过时间分辨方式区别背景荧光（钠秒级），正是由于荧光衰变时间长，可以延缓测量时间，等待测样品中短寿命的本底荧光衰变后再测稀土离子的特异荧光，因此可完全消除本底荧光的干扰，提高检测的灵敏度[4]。

时间分辨荧光是一种特殊的荧光现象，也是一种基于分子吸收光能后以光辐射的形式去活化的过程。这个方法的原理如图1所示。

图1 镧系元素复合物发光机理Fig.1 Luminescence mechanism of lanthanide complexes

依据弗兰克-康登规则，分子中处于单线态基态电子能级S0的电子吸收一定波长的电子后，被激发至单线态激发态电子能级（一般是S1态）中的某一振动能级，这一过程约10-15s；在经历短暂的振动弛豫过程后（10-12s～10-10s），会有大量电子在 S1态的最低振动能态积累，处于该状态的电子会有几种释放能量回到基态S0态的途径，包括振动弛豫在内的这些途径被统称为去活化的过程，若能量释放的过程中伴随着光子的放出，则称为辐射跃迁去活；若只是通过碰撞等途径释放能量，而没有光子放出，则称为非辐射跃迁。非辐射跃迁过程有以下几种途径：（1）内转换，电子在具有相同多重度的电子能态间发生跃迁的过程，时间通常在10-11s～10-9s；（2）系间跨越是电子在不同多重度的能态间发生跃迁的过程，如单线态S1至三线态T1的跃迁，其时间通常在 10-10s～10-8s；（3）荧光淬灭是激发分子通过分子间的相互作用和能量转换，从而释放能量的过程，也称作外转换。

荧光发射即为一种常见的辐射跃迁过程，它通常是指电子发生自S1态至S0态的跃迁，同时放出光子的过程。该过程通常在10-10s～10-7s。时间分辨荧光则是在最后将能量转移到镧系元素复合物的中心离子，通过其4f-4f能量跃迁而发出特定的荧光，因此荧光寿命长，Stokes位移大，可以排除非特异性荧光信号的干扰。利用光学仪器检测荧光发射的强度随时间的变化，即可得到体系的荧光寿命信息。

时间分辨光谱是固定波长处荧光随时间变化，是一种瞬时光谱，是激发光脉冲截止后相对于激发光脉冲的不同延迟时刻测得的荧光发射，反映了激发态电子的运动过程（即荧光动力学）。一般测量的是荧光衰减谱，即固定检测的激发波长和发射波长，记录荧光强度随时间的变化。通常采用基于时域的脉冲法和基于频域的相移法[5-6]。

1.2 TRFA的特点

TRFA是以镧系元素及其复合物作为荧光标记物，有以下特点[7]。

荧光发射峰很窄，使荧光检测具有很高的效率，进一步提高了信号检测的特异性和灵敏性。激发光光谱比较宽，通常在300 nm～500 nm，可通过增加激发光能量来提高灵敏度。

荧光发射峰和激发峰之间有很宽的Stokes位移，使容易通过波长分辨方式进一步区别背景荧光，提高方法的稳定性。镧系元素离子螯合物荧光的衰变时间比传统荧光时间长很多，因此可以等其它物质的荧光衰变后再测量，极大地降低了本底荧光，使敏感性提高。镧系离子由激发态跃迁到基态时发射荧光，可多次激发镧系离子，使标记比活性大大提高。

2 TRFA在食品污染物检测中应用进展

食品污染物是指凡不是有意加入食品中，而是在生产、制造、处理、加工、填充、包装、运输和贮藏等过程中加入食品的任何物质，但不包括昆虫碎体、动物毛发和其它不寻常的物质。食品在从生产（包括农作物种植、动物饲养和兽医用药）、加工、包装、贮存、运输、销售，直至食用等过程中产生的或由环境污染带入的、非有意加入的化学性危害物质。食品污染分为生物污染、化学污染和物理污染，主要的食品污染物包括细菌、病毒、寄生虫、真菌、生物毒素、杀虫剂、抗生素、农兽药残留和有毒重金属等。随着国内外食品安全标准越来越严格，对检测方法提出了更高的要求，尤其是在高通量高灵敏度方面，虽然常见的检测方法高效液相色谱法、质谱分析法、原子光谱法等也能实现高灵敏度的检测，但是这些方法的前处理过程复杂、对设备要求较高且检测时间长；而且一些食品污染物如重金属、真菌毒素等还具有蓄积毒性，会导致疾病的发生，因此高灵敏度的检测方法是检测污染物浓度水平和开展膳食暴露评估的重要工具。由于时间分辨荧光分析技术的高灵敏度，结合免疫学等快速检测技术，已被广泛应用于食品污染物的检测。TRFA在食品污染物检测中的应用包括生物污染和化学污染，在生物污染方面，TRFA检测的主要是微生物和真菌毒素，化学污染方面检测的主要是农兽药和重金属。

2.1 TRFA应用于食品中微生物的检测

微生物种类繁多，它们广泛存在于自然界和人们的正常生产、生活中，但是食品中某些微生物的存在会使人的健康受到威胁，为了更好地保护人们的健康和控制食品产品的卫生安全，食品中微生物的检测是食品检测工作的重点内容[8-9]。

Yu等[10]建立了一种基于免疫磁分离和时间分辨荧光分析技术检测苹果酒中O157∶H7大肠杆菌的免疫分析方法，时间分辨荧光免疫分析法采用与免疫磁头结合的多克隆抗体作为捕获抗体，用铕标记的同一抗体作为检测抗体。Jaakohuhta等[11]使用时间分辨荧光分析技术，以包含乳胶纳米颗粒的铕（Ⅲ）螯合剂作为示踪剂，增加夹层免疫分析的灵敏度，建立了检测李斯特菌的纳米免疫分析法。Kulpakko等[12]建立了一种检测大肠杆菌的方法，使用特异噬菌体破裂大肠杆菌，在没有大肠杆菌的情况下，不能形成发光的Eu3+螯合物，并监测到低时间分辨的发光信号，在大肠杆菌存在的情况下，当细胞内容物被过滤到周围的培养基中时，可以观察到发光信号的增加，且发光信号是样品中细菌数量的函数。Bouchard等[13]建立了一种检测肉表面细菌的时间分辨荧光分析技术，利用时间分辨荧光分析技术高灵敏度检测肉表面细菌和副产物自发的荧光。

2.2 TRFA应用于食品中真菌毒素的检测

真菌毒素是一种由真菌产生的小分子有毒次级代谢产物，食品中的真菌毒素主要是由霉菌产生的，污染食品后引起的危害主要是真菌引起食物变质和真菌产生的毒素引起中毒，造成经济损失和威胁身体健康[14]。粮食和饲料在生产、收获、储存及加工过程中容易受到霉菌的污染引发霉变，其中玉米、大米、花生、小麦被污染真菌毒素的种类最多[15]。对人类危害严重的真菌毒素主要有黄曲霉毒素（aflatoxin，AFT）、赭曲霉毒素 A（ochratoxin，OA）、展青霉素（patulin，PAT）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、橘霉素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）等。

TRFA应用于真菌毒素的检测主要基于不同的检测原理，如免疫学检测原理、适配体检测原理。Wang等[16]使用时间分辨荧光免疫层析试纸对大豆酱油中的黄曲霉毒素B1进行检测，是一种将时间分辨荧光和免疫层析结合起来的快速定量检测毒素的方法，动态检测范围是 0.3 μg/kg～10.0 μg/kg，最低检测限是0.1 μg/kg；Zhang等[17]也建立了一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测微囊藻毒素（microcystin，MC）。Niazi等[18]制作了一个适体传感器利用时间分辨荧光同时检测玉米中的赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）和伏马菌素B1（fumonisin B1，FB1），检测原理是使用适配体与纳米磁性粒子结合作为捕获探针、cDNA与信号分子结合作为信号探针，没有目标毒素的时候，通过DNA的杂交和磁分离发出荧光获得信号，有目标毒素的时候，目标毒素与信号探针竞争结合捕获探针，使得发出的荧光信号降低，FB1和OTA的检出限分别为0.019 pg/mL和0.015 pg/mL，远低于之前所述的同时识别FB1和OTA真菌毒素的方法；Wen等[19]建立了一种快速、灵敏的时间分辨荧光分析技术检测志贺毒素2（shiga toxin2，Stx2），在夹心模式下，将抗Stx2的单克隆抗体包覆在微滴度板上作为捕获抗体。使用铕（III）螯合物标记的Stx2示踪抗体作为检测器，然后使用时间分辨荧光进行荧光测量；Huang等[20]以多色镧掺杂的时间分辨荧光纳米粒子作为生物探针，建立了检测牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素的方法。

2.3 TRFA应用于食品中农药残留和兽药残留的检测

农兽药本身是用来保护动植物的，但是一些不正确的操作可能导致动植物农兽药残留含量的超标，从而危害人体的健康，所以需要采取一定的检测措施监测市场上动植物产品的农兽药含量是否符合国家标准[21-23]。

Tang等[24]开发了一种用于谷物食品中农药残留和霉菌毒素同时检测的定量纸传感器，该原理是包被抗原和检测的有害化学物质竞争结合Eu（Ⅲ）标记的单克隆抗体，在阴性样品中，单克隆抗体均与包被抗原结合，具有最大的荧光信号。在阳性样品中，有害化学物质与部分单克隆抗体结合，导致与包被抗原结合的单克隆抗体数量减少，荧光信号值降低，所以随着有害化学物质的浓度增加荧光信号降低；Zhang等[25]建立了检测农产品中卡巴呋喃残留量的方法，卡巴呋喃是氨基甲酸酯类广谱内吸杀虫杀螨杀线虫剂，试验是基于双标免疫探针，一种是与铕微球偶联的卡巴呋喃特异性抗体作为T信号，另一种是小鼠免疫球蛋白G与铕微球偶联作为对照C信号，通过建立卡巴呋喃浓度与T/C之间的定量关系确定卡巴呋喃浓度；Peippo等[26]建立了一种用于家禽血浆中那拉霉素检测的时间分辨免疫分析法，那拉霉素可以用于预防禽球虫病，该方法的判断限和检测能力分别是1.2 ng/mL和1.5 ng/mL。Hagren等[27]建立了一种竞争性的时间分辨荧光免疫分析法，可用于鸡蛋中莫能菌素残留的定性和定量测量；Le等[28]采用双标时间分辨荧光免疫分析法同时测定食用动物组织中金霉素和强力霉素的含量，使用铕和钐标记抗体。

2.4 TRFA应用于食品中重金属的检测

重金属是比重大于5的金属，一些重金属是维持人体生命活动所必需的，而一些重金属的摄入超标则会严重损害人体器官，威胁到人们的生命安全[29]。所以需要在食品进入市场之前，对食品中的重金属进行检测，防止重金属含量超标的食品进入市场。

Lin等[30]设计了一种基于蛋白/镧系络合物[牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）/Tb3+]的传感器阵列，可以用于时间分辨荧光检测铁、铜、铬等17种金属离子，该方法的原理：由于BSA到Tb3+的能量转移，BSA/Tb3+能增强射频调谐（tuned radio-frequency,TRF），而BSA可以通过Asp和Glu的羧基与金属离子结合，且BSA与金属离子之间的高亲和力会诱导BSA/Tb3+配合物的构象变化从而对于每种金属都有不同的TRF响应，所以可以检测不同的金属离子。

3 展望

由于TRFA的高灵敏度、分析速度快，在医学检测中应用十分广泛；随着食品污染物限量值降低，对高毒性污染物检测方法灵敏度要求提高，TRFA技术在食品领域的应用越来越广泛。TRFA目前主要应用于免疫分析领域，免疫学检测方法主要取决于抗体的制备，但是由于某些小分子抗体制备较为困难，而更适用于小分子的适配体技术，因此抗体库的完善以及适配体的快速筛选技术成为未来TRFA的重要发展方向。此外，在分子生物学检测领域，由于镧系复合物相比传统染料的优势，TRFA在核酸检测方向的应用研究也非常具有潜力。