急性心肌梗死患者血清CD137、mir-335-5p水平及其与预后的关系

白婷婷，祁华琪，聂晓东

急性心肌梗死（AMI）多由动脉粥样硬化所形成的血栓而引起心肌缺血性坏死，从而导致具有极大致死性的急性病症[1]。因此AMI的早期诊断和治疗对于保护心脏功能尤为重要。AMI常伴眩晕，耳鸣、呕吐、昏迷不醒等症状，严重威胁人们生命健康[2]。

肿瘤坏死因子受体超家族成员9（CD137）是肿瘤坏死因子受体超家族成员之一，在自然杀伤细胞和T淋巴细胞中起重要的免疫调节作用，可促进促炎因子的分泌，引发炎症反应[3]。微小RNA（miRNA）是一个非编码核糖核酸家族，在转录后调节基因表达，在细胞自我更新、发育、分化、生长和代谢中起重要调控作用[4]。有研究表明，多种miRNA与动脉粥样硬化的斑块形成有关，可作为其生物标志物，且在冠心病发生中起重要调控作用[5,6]。微小RNA-335-5p（miR-335-5p）作为miRNA家族成员之一，具有作为AMI生物标志物的潜能。本研究通过检测miR-335-5p和CD137在AMI患者血清中的表达情况，探讨两者对AMI的影响及与预后关系，以期为AMI发病机制的研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象本研究选取2015年3月～2017年6月于河南省第二人民医院已确诊收治的发病短期内就医的85例AMI患者，平均年龄（50.37±18.26）岁；其中男性45例，女性40例，均符合AMI纳入标准。对照组包括73例健康者，平均年龄（48.31±15.08）岁；其中男性39例，女性34例。纳入标准：发病时间＜2 h并符合AMI诊断标准；资料完备。排除标准：患有其他心脏疾病或近期行手术等相关治疗。本研究经我院伦理委员会批准，患者和对照组均签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器本实验主要试剂：UltraSYBR Mixture（Low ROX）（货号：CW0956，购自康为世纪公司）；RNA提取试剂盒（货号：DP441，购自北京天根生化有限公司）；PrimeScriptTM RT Master Mix（货号：RR047AA，购自日本Takara公司）。人心肌钙蛋白I（cTnI）ELISA试剂盒（货号：KL00503，购自南上海康朗生物科技有限公司）；CD137 ELISA试剂盒（货号：1535473809，购自上海江莱生物科技有限公司）；MyO ELISA试剂盒（货号：YEF10701，购自上海羽朵生物科技有限公司）。本实验主要仪器：高速低温离心机（JW-3021HR，购自嘉文设备有限公司）；荧光定量PCR仪（LightCycler®96）购自上海罗氏诊断产品有限公司；全自动酶标仪（RT2100C）购自德国IFP公司。

1.3 研究方法

1.3.1 样品采集及保存AMI患者在入院时和发病4 h和8 h时抽取静脉血4 ml；对照组清晨空腹抽取静脉血4 ml，2500 rpm离心10 min后收集血清于-80 ℃保存待测。

1.3.2 qRT-PCR法检测血清中mir-335-5p表达水平使用RNA提取试剂盒（天根）提取出血清中总RNA后反转录成cDNA（反应体系如下所示）。以此为模板，采用qRT-PCR检测血清中mir-335-5p的表达水平（反应体系如下所示）。用U6作为内参对mRNA标准化，通过2-△△Ct分析mir-335-5p的表达。用Primer 6.0和Oligo 7软件设计引物（引物长度为18～22bp，扩增长度100～300bp，表1），送华大基因进行合成，经10倍稀释备用。

表1 实时荧光定量PCR引物

反转录反应体系：Total RNA（1000/c）；RNase Free dH2O（up to 20 μl）；Mix（4 μl）。

PCR反应体系：cDNA模板0.25 μl；ddH2O 5 μl；Primer-F 0.5 μl；Primer-R 0.5 μl；2×Taq PCR master mix 6.25 μl。

1.3.3 ELISA法检测血清中CD137、肌钙蛋白I（cTnI）、肌红蛋白（MyO）的表达水平根据ELISA试剂盒说明书检测所有研究对象血清中CD137、cTnI和MyO蛋白表达水平。

1.4 随访随访3年，从术后为随访开始时间，死亡患者以死亡时间为随访截止日期，生存患者至3年期满结束，以电话、复查等方式登记患者生存情况。

1.5 统计学分析使用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料表示形式采用均数±标准差（±s）。两个独立样本之间采用t检验；计数资料以百分比表示，组间比较采用卡方检验；采用Pearson相关系数分析CD137、mir-335-5p与cTnI、MyO表达水平的相关性，采用Kaplan-Meier曲线分析 CD137、mir-335-5p表达水平与预后的关系，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较两组患者的年龄、性别、饮酒史、高血压史和吸烟史、糖尿病史和高血脂病史等基本资料之间无统计学差异（P＞0.05），表2。

表2 两组基本资料的比较

2.2 血清中CD137、mir-335-5p、cTnI和MyO水平检测情况由结果可知，与对照组相比，入院时AMI组CD137、cTnI和MyO水平显著增加（P＜0.05），而mir-335-5p表达水平则显著降低（P＜0.05）；与入院时相比，在发病4 h和8 h时AMI组患者血清中cTnI、MyO、CD137水平显著增加，而mir-335-5p表达水平则显著降低（P＜0.05）；在发病8 h时，AMI组患者血清中cTnI、MyO、CD137水平与4 h时相比显著增加，而mir-335-5p表达水平则显著降低（P＜0.05），表3。

表3 血清中CD137、mir-335-5p、cTnI和Mb的表达水平

2.3 AMI患者血清中CD137、mir-335-5p与cTnI、MyO表达水平的相关性Pearson法分析发现，AMI患者血清中CD137与cTnI、MyO表达均呈明显正相关关系（r=0.778、0.555，P＜0.05），图1～2。AMI患者血清中mir-335-5p与cTnI、MyO表达均呈明显负相关关系（r=-0.506、-0.617，P＜0.05），图3～4。

图1 AMI患者血清中CD137与cTnI表达相关性分析

图3 AMI患者血清中mir-335-5p与cTnI表达相关性分析

2.5 血清中CD137、mir-335-5p表达水平与预后的关系在3年随访中发现，85例患者中生存60例，死亡25例，生存为70.59%。将AMI患者以CD137、mir-335-5p表达的中位数分为两组，大于中位数为高表达组，小于中位数为低表达组。CD137低表达患者生存率为83.33%，而高表达组生存率为58.14%，两组比较logrank值为6.397，P=0.011；mir-335-5p高表达组生存率为77.27%，低表达组生存率为63.41%，两组比较logrank值为3.157，P=0.046，图5～6。

图2 AMI患者血清中CD137与MyO表达相关性分析

图4 AMI患者血清中mir-335-5p与MyO表达相关性分析

图5 CD137表达与AMI患者预后生存的关系

3 讨论

AMI是现今最常见的疾病之一，有许多诱发因素如：饮酒过量、激动过度、吸烟等，而随着饮食的改变和快速的生活节奏，AMI的发病率逐年增加，其中大约50%的患者是亚洲人种，目前与其相关的研究虽逐渐增加，但关于其发病机制的数据资料仍严重缺乏[7,8]。AMI的发病机制复杂多样，有研究表明炎症因子与心血管疾病的发生有关，在冠心病发生过程中，炎症反应与动脉粥样硬化斑块的形成有直接关系[9,10]。有研究表明，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）等促炎因子表达增加可对血管内皮造成严重损伤[11,12]。还有研究表明，AMI发病时，cTnI、MyO等标志物异常表达，可作为AMI早期诊断指标[13,14]。此前，关于miR-335-5p和CD137表达水平与AMI相关性以及预后关系的研究还未被探讨过，因此本研究通过检测miR-335-5p和CD137在AMI患者血清中的表达情况，探讨两者对AMI的影响以及与预后的关系。

图6 mir-335-5p表达与AMI患者预后生存的关系

近期有研究表明，miRNA能够通过调控多种基因表达来调节心肌细胞功能，参与血管生成，并且可发挥抗纤维化作用[15,16]。刘志立等[17]发现血清中miR-29b、miR-424的高表达会促进炎症反应过度发生，导致血管损伤并造成心肌缺血从而致使AMI的发生。袁梅等[18]研究发现，在急性缺血性脑卒中患者血清中miR-335表达降低，这表明miR-335有成为AIS诊断及预后检测指标的潜能。该结果与本试验结果相似：本研究中，与对照组相比，AMI患者血清中mir-335-5p表达水平显著降低，并且随着发病时间延长其表达水平持续降低，这表明mir-335-5p可用于跟踪病情发展状况。Pearson法分析发现，mir-335-5p与cTnI、MyO表达均呈明显负相关关系，说明mir-335-5p可能与cTnI、MyO相互影响，从而参与AMI的发生发展；此外，在为期3年的预后随访中发现，mir-335-5p高表达患者预后生存率高于低表达者，这表明mir-335-5p水平可能对预测AMI患者预后有一定价值。因此mir-335-5p可作为AMI早期监测和预后情况判断的检测指标。

CD137是肿瘤坏死因子家族之一，主要在活化的T淋巴细胞CD8+中表达，而CD8+与斑块的增加有密切相关性，并且可增加心血管疾病的发生[19]。有研究表明CD137能够促进斑块形成及炎症反应的发生[20]。在血清中能够以可溶形式sCD137存在。王宁等[21]研究发现激活CD137信号通路可促使血管平滑肌细胞和动脉粥样斑块发生钙化。本研究结果也发现AMI患者血清中CD137、cTnI、MyO表达水平显著上调；并随着发病时间的延长在4～8 h内持续增加，这表明CD137可能参与AMI患者的疾病进展。Pearson法分析发现，AMI患者血清中CD137与cTnI、MyO表达均呈明显正相关关系，表明三者间可能存在某种相关机制共同参与AMI的发生；此外，在为期3年的预后随访中发现，CD137低表达患者预后生存率高于CD137高表达者，这表明CD137可作为AMI疾病发生发展和预后监测指标。

综上所述，AMI患者血清中CD137表达水平显著增加，而mir-335-5p表达水平则显著降低；此外，CD137低表达和mir-335-5p高表达患者预后生存率更高。表明两者参与AMI的发生与发展机制，其表达水平可作为检测AMI发病的重要参照指标，且可用于判断患者预后情况，具有作为AMI诊断生物标志物的潜能。