血卟啉单甲醚介导的光动力疗法对胃癌细胞MGC-803的光动力杀伤效应

陈强 刘立凤 高越

光动力疗法（PDT）是利用肿瘤细胞的高代谢特点来治疗肿瘤的一种新方法，其原理是光敏剂可以选择性地进入肿瘤细胞并被特定波长的光激活，引起一系列光化学反应，产生单线态氧和自由基，从而杀死肿瘤细胞［1］。血卟啉单甲醚（HMME）是常用的光敏剂，其介导的PDT已广泛应用于整形美容、细菌感染及恶性肿瘤的治疗［2-4］，通过特定波长的激光来激活HMME可以产生肿瘤杀伤效应，在内窥镜PDT治疗中激光纤维通过内窥镜活检通道进入腔道，造成肿瘤的原位破坏而正常组织不受损伤，具有毒性局限、损伤小的特点，且反复PDT治疗不易产生耐药性［5］，目前用于胃癌的治疗研究较少，本实验旨在研究HMME-PDT对胃癌细胞MGC-803的生长抑制作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与光源 血卟啉单甲醚（冻干粉状态）购自上海先锋药业有限公司，其最佳吸收光谱为630 nm［6］，胃癌细胞MGC-803系获自哈尔滨医科大学细胞中心，RPMI-1640培养基和胎牛血清（FBS）均购自美国Hyclone Laboratories公司，链霉素和青霉素均购自苏州碧云天生物技术公司，ApoAlert Annexin V-FITC试剂盒购自美国BD生物科技公司，细胞计数试剂盒8（CCK8）购自武汉博斯特生物工程有限公司。选用的光源为二极管激光器（日本东京三洋电机株式会社），其最大输出功率为260 mW，波长为635 nm。光通过具有0.8 mm圆柱形扩散尖端的光纤施加器分布，照射前将输出功率调整为50 mW，并将产生的光线进行光学准直至直径为0.8 cm的光斑尺寸。激光输出能量用功率计仔细校准，以避免过度曝光。

1.2 细胞培养 将胃癌细胞MGC-803接种于含有10%胎牛血清、50 μg/ml链霉素和50 μg/ml青霉素的RPMI-1640培养基中，置于37 ℃、含有5%CO2的湿润培养箱中进行培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 研究方法 （1）荧光检测与光谱分析：将细胞接种于96孔板培养基中，约1×104个/孔，置于培养箱中培养24 h，细胞贴壁后，倾去原培养液，每个孔中加入一定量的HMME，并加入新的培养基，使之浓度为2 mg/L，每个孔设置四个复孔，分别孵育不同时间（0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210 min、240 min、270 min、300 min），采用波长405 nm、带宽20 nm的光源照射，激发进入胃癌细胞MGC-803的HMME发出荧光，使用光纤接收发出的荧光，采用Origin7软件进行荧光光谱分析，确定HMME的最佳孵育时间。（2）细胞形态观察：在6孔板上培养的细胞与2 mg/L HMME孵育90 min（最佳孵育时间）后，用10 μg/ml DAPI（Hoechst 33342）染色10 min，荧光显微镜下观察细胞的形态。

1.4 细胞活力测定 将胃癌细胞MGC-803与不同浓度（0 mg/L～4 mg/L）的HMME在黑暗环境下孵育90 min后，行激光照射（波长630 nm，光功率50 mW，照射距离2 cm，照射面积0.5 cm2），输出功率为100 mW/cm2；照射时间分别为0 s、20 s、40 s、80 s，产生的光能量强度分别为 0 J/cm2、2 J/cm2、4 J/cm2、8 J/cm2。然后在每个孔中加入10 μL CCK8试剂，将细胞置于37 ℃培养箱中孵育2 h，之后立即检测490 nm处每个孔的光密度（OD）。细胞存活率=（实验组OD-空白对照组OD）/（对照组OD-空白对照组OD）×100%。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以（）表示，采用单因素方差分析及Dunnett检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HMME在胃癌细胞MGC-803中的聚集和荧光光谱分析 经2 mg/L HMME孵育90 min的胃癌细胞MGC-803 用 10 μg/ml DAPI（Hoechst 33342）染色后，核染成蓝色，红色荧光代表MGC-803细胞中聚集的HMME，见图1a；未与HMME孵育的细胞，细胞浆未显示红色荧光，见图1b。胃癌细胞MGC-803的荧光强度随着孵育时间的增加而迅速增加，在90 min达到峰值，然后急剧下降，并在210 min时达到另一个峰值，但低于前一个峰值，提示HMME与MGC-803细胞的最佳孵育时间为90 min，见图2。

图1 胃癌细胞MGC-803的荧光显微照片

2.2 显微镜下胃癌细胞MGC-803的形态与数量变化 未经HMME或光照射处理的胃癌细胞MGC-803呈长梭状，边缘锐利，见图3a；经2 mg/L HMME介导的PDT（4 J/cm2）诱导的MGC-803细胞形态发生明显改变，变圆、起皱甚至破裂，存活的细胞数量明显减少，见图3b。

图 2 胃癌细胞MGC-803的HMME荧光光谱分析图

图3 胃癌细胞MGC-803的形态学变化

2.3 胃癌细胞MGC-803的存活率测定及分析 单纯给予0.25 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L HMME孵育，未经激光照射的胃癌细胞MGC-803几乎无明显变化；当HMME浓度达到2 mg/L时，细胞存活率下降至（83.22±1.69）%（P=0.011）；HMME浓度达到4 mg/L时，细胞存活率进一步下降至（81.70±3.04）%（P=0.006）；HMME浓度达到8 mg/L时，细胞存活率（78.81±1.54）%下降更明显（P=0.002）；可能是过量HMME引起的细胞毒性作用。单纯用激光照射未经HMME处理过的细胞，其存活率差异无统计学意义（P＞0.05）；光强度为2 J/cm2时，细胞存活率为（94.68±2.73）%（P=0.44）；光强度为4 J/cm2时，细胞存活率为（92.62±6.22）%（P=0.48）；当光强度增加至8 J/cm2时，存活率为（92.40±6.34）%（P=0.41）下降不明显。当与激光照射结合时，不同浓度的HMME可以实现不同程度的细胞抑制作用，即使使用最低浓度的HMME（0.25 mg/L）也可显著降低胃癌细胞MGC-803的存活率（P＜0.01）。不同强度的光照亦存在这样的趋势。经4 mg/LHMME和8 J/cm2的激光处理后，胃癌细胞MGC-803的存活率几乎降低到最小值（5.63±1.51）%。当HMME浓度达到8 mg/L，肿瘤细胞的存活率没有再明显降低（P=0.15）。见图4a。

使用固定浓度的HMME作为光敏剂，不同强度的光照射对MGC-803细胞产生不同程度的生长抑制作用。研究发现，胃癌细胞MGC-803的存活率与光动力学因子B呈近似e指数衰减关系。光动力因子B=光输出功率×照射时间×HMME浓度（B=I0×t×C）。见图4b。

图4 胃癌细胞MGC-803的存活率测定及分析图。a. 与对照组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01，NS代表差异无统计学意义；b. 实心圆表示细胞存活率，红色曲线显示其与光动力学参数B的指数拟合

3 讨论

光动力疗法（PDT）是治疗胃癌的新兴替代方案，基于其靶向能力强、毒性低、治疗效果好等特点，有学者认为PDT是食管癌、胃癌和结肠癌患者的一线潜在疗法［5，7］。光敏剂的选择是充分发挥PDT疗效的一个重要途径，本研究使用的血卟啉单甲醚（HMME）为新开发的光敏剂，再次证明了PDT的功效，验证了HMME顺利进入MGC-803细胞。根据荧光检测光谱的数据分析发现，MGME-803细胞中HMME在90 min时达到浓度峰值，孵育时间过长会导致细胞损伤甚至死亡，从而影响实验结果。后续的实验中均采取最佳孵育时间即90 min，以求在最佳时间内达到最好的治疗效果。HMME必须被激光激发以产生化学反应，如产生诱导细胞凋亡的活性氧（ROS）［5］，单纯使用HMME处理肿瘤细胞是没有杀伤效应的（P＞0.05），而浓度超过2 mg/L时可单独产生细胞毒性作用（P＜0.05），由此可证明HMME对正常细胞的低毒性作用。本实验还发现，HMME一旦结合激光照射就会展现其高效的杀伤效应，肿瘤细胞死亡率达90%以上。PDT有三个重要元素，光输出功率、照射时间和光敏剂浓度，前两者的乘积可表示为光强度。实验中MGC-803细胞的增殖能力受到显著抑制，与光动力因子B密切相关，光动力因子B=光输出功率×照射时间×HMME浓度（B=I0×t×C）。随着B值在20 W·mg/L·min范围内增加，存活细胞明显减少，总趋势呈指数衰减曲线。当B值达到30 W·mg/L·min时，细胞存活率几乎达到最小值。从拟合曲线可以看出，只要B值保持恒定，通过调节光强度或HMME浓度值，均可达到几乎相同的细胞杀伤效果。临床上，对于合并肝肾功能不全的患者，在确保相同治疗效果的情况下，可以适当降低HMME的浓度，增加光强度即通过增加曝光时间或输出功率，可最大程度地降低肝肾损害。与其他肿瘤不同，胃肠道肿瘤通常需要内窥镜装置来引导PDT进入消化道，因此曝光时间也应该考虑在内，对于不能反复进行内窥镜检查或长时间治疗的患者，需要缩短接触时间或降低治疗频率，通过增加HMME浓度或光输出功率以确保最佳治疗，同时使得其他器官受损最小化。

综上，HMME介导的PDT是抑制MGC-803细胞增值的有效方法，光动力因子B与细胞存活率之间的关系曲线可指导PDT的临床应用，但还需进一步实践评估其作用价值。