miR-222对甲状腺乳头状癌侵袭与转移的作用机制

张伟兰 毛玉山

甲状腺乳头状癌（PTC）是甲状腺癌的最常见亚型，转移是导致PTC患者死亡的主要原因，近一半转移患者在5年内死亡［1］。微小RNA（miRNA）是一类保守短链非编码RNA［2］，研究发现，miRNA参与PTC发生、发展［3-5］。多种 miRNA在 PTC 中表达异常［6-7］，在部分PTC患者循环血中miR-222存在高表达，并与淋巴结转移和肿瘤晚期阶段密切相关［1，8］。但目前有关miR-222在PTC的侵袭、转移中的作用及机制的研究较少。p53-2促凋亡蛋白（ASPP2）是p53家族成员中的肿瘤抑制因子，ASPP2下调与癌症侵袭表型和不良预后相关［9］。由miRNA调控ASPP2的潜在机制及其对PTC的影响尚待阐明。笔者拟通过体内外研究明确miR-222对PTC侵袭和转移的影响，并探索miR-222通过调控ASPP2影响PTC进展。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）细胞与试剂：人甲状腺正常细胞系Nthy-ori 3-1、人甲状腺乳头癌BCPAP和K1细胞均购自浙江如耀生物科技有限公司。K1、BCPAP和Nthy-ori 3-1细胞使用RPMI 1640加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素，在37℃含有5% CO2的细胞培养箱中培养。（2）实验动物：24只雄性SPF级BALB/c小鼠（5～6周龄）购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养在宁波大学实验动物中心SPF屏障系统。动物实验方案经宁波大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 研究方法 （1）质粒转染：从NCBI上获取miR-222序列，进行过表达及沉默的引物设计。利用pCDH-H1-GFP-puro和pLKO.1-puro质粒分别构建miR-222稳定表达和沉默质粒。转染293T细胞得到慢病毒，感染PTC细胞后嘌呤霉素筛选，获得miR-222稳转细胞株，采用RT-PCR检测miR-222的转染效率。miR-222过表达引物序列，XbaI-上游引物-5'-TGC TCT AGA GCT GCT GGA AGG TGT AGG TA-3'、EcoRI-下游引物-5'-CCG GAA TTC GTA CCT ACA CCT TCC AGC AG-3'；miR-222沉默引物序列，上游引物-5'-CCG GCC AGT GTA GAT CCT GTC TTT CCT CGA GGA AAG ACA GGA TCT ACA CTG GTT TTT G-3'、下游引物-5'-AAT TCA AAA ACC AGT GTA GAT CCT GTC TTT CCT CGA GGA AAG ACA GGA TCT ACA CTG G-3'。（2）Transwell侵袭实验 ：在包被有Matrigel的Transwell小室中，加入100 μL密度为4×105细胞/mL的单细胞悬液，下室加入含血清的完全培养液，培养48 h后取出小室，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，显微镜下计数侵袭细胞数。（3）迁移实验：细胞铺板后，汇合度100%时，用20 μL的吸头进行划痕处理，待24 h后于倒置显微镜下观察、拍照。（4）双荧光素酶报告基因检测：用TargetScan和miRanda软件预测miR-222潜在的靶基因及结合序列，合成ASPP2的野生型和突变型序列的引物，使用pISO质粒构建双荧光素酶报告基因质粒，pRL-TK作为内参质粒。293T细胞在60%～80%融合度时用Lipo 3000进行转染，miR-222 mimic及mimic NC 各2.5 μL（金唯智公司合成），终浓度为100 nM。结合promega的双荧光素酶报告系统，使用Promega GloMax进行测量，相对荧光素酶活性以萤火虫荧光素酶活性与Renilla荧光素酶活性的比值来表示。其中，野生型ASPP2扩增引物序列，ScaI-上游引物-5'-AAA GAG CTC ATT ATA TGA GTT TTT GTA GCA-3'、XbaI-下游引物-5'-TGC TCT AGA CTT GCT ACA GAC TTA CCC GTA-3'；突变型ASPP2扩增引物序列，ScaI-上游引物-5'-AAA GAG CTC TTT ATA AGA GTT TTA CAT CGA-3'、XbaI- 下游引物-5'-TGC TCT AGA CTT GCT ACA GAC TTA CCC GTA-3'。（5）免疫印迹：收集细胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解5 min，取部分裂解液，BCA法测定蛋白浓度。剩余蛋白煮沸变性后，SDS-PAGE分离，转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入兔抗ASPP2抗体（货号：ET1702-79，华安抗体公司），1∶1000比例稀释，4 ℃孵育过夜。弃一抗，加羊抗兔IgG-HRP二抗（货号：HA1001，华安抗体公司）室温孵育1.5 h～2 h，ECL发光液显色，UVP蛋白成像仪进行曝光拍摄，以β-actin为内参蛋白对目标蛋白进行相对定量。（6）qPCR检测ASPP2表达：采用Trizol法提取细胞以及临床样本的RNA，参照一步法PCR试剂盒和RT-PCR相关试剂盒的说明书，得到cDNA。荧光定量检测试剂盒检测ASPP2的表达情况。ASPP2 qPCR引物序列如下，上游：5'-AGC ACT GGG AAT GCT CTG GAT C-3'，下游：5'-GGC ATT GGA CTG GTC TAC TGC A-3'；GAPDH qPCR引物序列，上游：5'-GTC TCC TCT GAC TTC AAC AGC G-3'，下游：5'-ACC ACC CTG TTG CTG TAG CCA A-3'。以GAPDH为内参，计算相对表达量，2-△△Ct=（Ct实验组目的基因-Ct实验组内参基因）-（Ct对照组目的基因-Ct对照组内参基因）。（7）qPCR检测miR-222表达：采用Trizol法提取细胞及临床样本的RNA，以U6为内参，参照miRcute增强型miRNA定量检测试剂盒说明书，检测miR-222的表达情况，基因相对表达量计算同（6）。其中，miR-222 qPCR引物序列，上游引物为5'-CTC AGT AGC CAG TGT AG-3'，下游引物为5'-GAA CAT GTC TGC GTA TCT C-3'；U6 内参引物序列，上游引物为5'-CTC GCT TCG GCA GCA CAT-3'，下游引物为 5'-TTT GCG TGT CAT CCT TGC G-3'。（8）肺转移能力测定：将24只雄性SPF级BALB/c小鼠分为空白对照组（Control组）、pCDH-miR-222过表达组和pLKO-miR-222沉默组，每组各8只。将100 μL细胞悬液通过尾静脉注入小鼠体内，1×106细胞/每只，6周后处死小鼠，肺组织在福尔马林中固定24 h，石蜡包埋，4 μm厚度连续切片，切片进行苏木精-伊红染色。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件。所有实验单独重复3次，计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-222在不同甲状腺癌细胞中的表达水平 甲状腺癌细胞BCPAP、K1的miR-222表达水平高于正常人甲状腺细胞Nthy-ori 3-1约6～7倍，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1A。慢病毒感染后miR-222在甲状腺癌细胞系中的表达水平显著上调，沉默miR-222后的甲状腺癌细胞miR-222的表达水平显著下调，与各自Control组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01），见图1B。

图1 A. qPCR检测miR-222基因表达水平，与Nthy-ori3-1组比较，★P＜0.05；B. qPCR检测慢病毒感染后甲状腺癌细胞中miR-222的基因表达水平，与各自control组比较，★★P＜0.01

2.2 miR-222与PTC细胞迁移和侵袭 在BCPAP和K1细胞中稳定过表达miR-222后，BCPAP和K1细胞系的迁移和侵袭能力显著增强。沉默miR-222后，BCPAP和K1细胞系迁移和侵袭能力显著减弱。结果显示，miR-222在体外显著增强PTC细胞的迁移力和侵袭性。见图2。

图2 A-B. 细胞划痕实验及其统计量化结果；C-D. Transwell细胞侵袭实验及其统计量化结果。与各自control组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01

2.3 miR-222靶向抑制ASPP2基因表达 miR-222可能与ASPP2 存在可结合位点，见图3。双荧光素酶基因报告系统检测结果显示，野生型ASPP2组中转染miR-222 mimic后，与mimic NC组比较，荧光强度被显著抑制（P＜0.05），而突变型ASPP2组并未观察该现象。通过检测miR-222稳转细胞株发现，miR-222沉默组中ASPP2的基因和蛋白表达显著高于miR-222过表达组（P＜0.05），见图4-6。在miR-222过表达的2个细胞株中转染ASPP2的过表达质粒后，显著削弱由miR-222引起的细胞迁移和侵袭能力增加，与对照组pCDH-miR-222比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图7。2.4 miR-222在体内增强肺转移 见图8。与对照组比较，注射过表达miR-222的PTC细胞的小鼠肺转移性结节的发生率显著增高（P＜0.05），而miR-222沉默组PTC细胞的肺转移发生率显著降低（P＜0.05）。

图3 生物信息学分析结果

图4 A. ASPP2与miR-222的结合位点以及ASPP2的突变序列；B. 双荧光素酶活性报告检测结果，★★P＜0.01

图5 A. qPCR检测ASPP2的基因表达水平，与Nthy-ori 3-1细胞比较，★P＜0.05；B. qPCR检测过表达或沉默miR-222时BCPAP和K1的ASPP2的基因表达水平，与各自control组比较，★★P＜0.01

图6 免疫印迹检测BCPAP和K1的ASPP2蛋白表达水平，与各自control组比较，★P＜0.05

图7 A. 表达ASPP2后对miR-222过表达细胞迁移距离的影响；B.表达ASPP2后对miR-222过表达细胞侵袭性的影响；与pCDH-miR-222比较，★P＜0.05

图8 A. HE染色结果；B-C. 肺结节生成数量化结果，与空白对照组比较，★P＜0.05

3 讨论

甲状腺乳头状癌（PTC）的发生是一个多因素、多步骤、多基因参与的复杂过程，基因突变、原癌基因激活、抑癌基因失活与一系列信号转导异常等改变贯穿始终。因此，根据分子机制寻找PTC发生发展的潜在作用靶点，在分子水平层面辅助PTC早期诊断、监测并干预病情发展，对指导PTC的临床诊疗具有重要意义。研究显示，miRNA在癌症的发生、发展中起着重要作用，通过调节细胞增殖、代谢、凋亡与侵袭进而促进癌变和转移过程［10］，其中miR-222因其在甲状腺癌、结肠直肠癌和胰腺癌等多种癌症中的表达上调，引起众多学者的关注。HE等［11］在甲状腺乳头状癌的研究中发现了5个过度表达的miRNA，miR-146、miR-221、miR-222、miR-21、miR-181，其中miR-222的表达水平高达正常组织的19倍。XIANG等［2］研究发现，miR-222在PTC中的表达明显高于正常甲状腺组织，且其表达水平与PTC的严重程度具有相关性，表明miR-222的表达水平在PTC风险分层中具有潜在参考价值。胶质瘤的相关研究发现，miR-222可能还参与癌细胞的侵袭和转移［12］，主要通过与蛋白质酪氨酸磷酸酶基因3'-UTR结合，下调该蛋白在胶质瘤中表达，进而促进细胞的侵袭和迁移。卵巢癌上皮细胞通过外泌体分泌的miR-222，可以促进单核细胞向肿瘤相关巨噬细胞转化，从而促进肿瘤的生长和转移［13］。可见，miR-222的表达异常与肿瘤的进展密切相关［14］，但miR-222在PTC侵袭、转移过程中的作用机制仍然未知。LIU等［15］研究证实，ASPP2与p53结合可以激活p53的抑癌功能，而ASPP2除了能够调控细胞凋亡，还可以调控肿瘤转移。所以，ASPP2蛋白很可能参与PTC的发生、发展、侵袭与转移过程，但miR-222与ASPP2的相关研究尚未见报道。

本文通过Transwell和双荧光素酶活性报告、肺转移实验来分析miR-222与PTC发展之间的关系，研究发现在体外增加miR-222可增强PTC细胞的迁移和侵袭能力，在体内可促进肺转移；miR-222可下调ASPP2表达，回复ASPP2表达后削弱由miR-222促进的PTC侵袭和转移。综前，miR-222通过下调ASPP2的水平可能是促进PTC侵袭与转移的机制之一，下一步研究可考虑设计miR-222特异性抑制剂，利用体内外模型考察抑制PTC转移的效果。