基于瘀毒互结病机理论探讨隐丹参酮联用三氧化二砷治疗胃癌的作用机制

杜仲燕 鲁军 赵正奇 张光霁

胃癌（Gastric cancer，GC）是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤。《2020年全球癌症统计报告》［1］显示，全球范围内胃癌的发病率（5.6%）居第5位，死亡率（7.7%）排第4位。近年来，随着诊断前移与治疗方式的多样化，早期胃癌患者的生存率有所提高，但晚期胃癌患者的预后仍然较差，中位生存期约为1年［2-4］。目前，中医中药在肿瘤进展、肿瘤耐药、改善症状等方面的独特优势，得到广泛关注。深入挖掘中医中药在胃癌治疗中的潜在靶点，阐明胃癌治疗的分子作用机制，已然成为研究的重点。基于大量的理论、实验和临床研究，张光霁教授创新性提出“久病必瘀、因瘀致毒、因毒致变、瘀毒互结”是中医肿瘤的核心病机之一，化瘀攻毒、瘀毒同治是中医肿瘤的主要治法［5］。本研究基于瘀毒互结病机理论，通过网络药理学工具探讨隐丹参酮联合三氧化二砷治疗胃癌的潜在靶点和分子作用机制，以期为新药研发和肿瘤临床治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 网络药理学相关工具 TCMSP数据库［6］（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）获取隐丹参酮相关靶点，Drugbank数据库（https：//go.drugbank.com/）获取三氧化二砷相关靶点，GeneCards数据库（https：//www.genecards.org）、DisGeNet数据库（http：//www.disgenet.org）、OMIM 数据库（（http：//www.omim.org）获取胃癌相关靶点，Draw Venn Diagrams（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）获取隐丹参酮合用三氧化二砷治疗胃癌的作用靶点，STRING数据库（https：//string-db.org/）进行PPI分析，Cytoscape3.7.0软件构建药物和疾病相互作用网络，R clusterProfiler进行GO和KEGG富集分析，Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）进行靶点校准。以上工具的使用时间截止至2021年5月。隐丹参酮联用三氧化二砷治疗胃癌的研究路线图，见图1。

图1 隐丹参酮联用三氧化二砷治疗胃癌的研究路线图

1.2 研究方法 （1）隐丹参酮与三氧化二砷靶点的获取：以Cryptotanshinone为检索词，通过TCMSP工具，检索隐丹参酮的相关靶点，并通过Uniprot工具进行校准；以Arsenic Trioxide为检索词，通过Drugbank工具，检索到三氧化二砷的相关靶点，并汇总靶点的Gene Name和Uniprot ID。（2）胃癌靶点的获取：以“Gastric Cancer”为检索词，通过GeneCards、DisGeNet和OMIM工具，检索胃癌的相关靶点，通过Draw Venn Diagrams工具去重后得到胃癌相关靶点的合集。（3）药物-疾病网络的构建及分析：通过Draw Venn Diagrams工具，获取隐丹参酮联用三氧化二砷治疗胃癌的作用靶点，并通过Cytoscape工具，构建药物-靶点-疾病网络。（4）蛋白互作网络（PPI）的构建：通过STRING工具，把隐丹参酮联用三氧化二砷治疗胃癌的相关作用靶点上传至工具，获取PPI网络。（5）GO与KEGG富集分析：通过R clusterProfiler，分析隐丹参酮联用三氧化二砷治疗胃癌的相关作用靶点的GO功能注释与KEGG信号通路富集。

2 结果

2.1 隐丹参酮与三氧化二砷的靶点 获取隐丹参酮的相关靶点共30个，获取三氧化二砷靶点10个，去重后共有39个潜在作用靶点。

2.2 胃癌靶点 通过GeneCards、DisGeNet和OMIM工具检索，分别获取胃癌靶点12153个、34个、505个，去重后共为12511个，见图2A。隐丹参酮联用三氧化二砷治疗胃癌映射得到38个共同靶点，见图2B。

图2 胃癌靶点与隐丹参酮联用三氧化二砷治疗胃癌的对应靶点

2.3 网络构建及分析 通过Cytoscape工具构建隐丹参酮联用三氧化二砷治疗胃癌的相互作用关系的可视化网络，发现不同的药物可作用于相同的靶点，也可作用于不同的靶点，充分体现了隐丹参酮联用三氧化二砷多靶点的作用机制。见图3。

图3 隐丹参酮联用三氧化二砷治疗胃癌的药物-靶点-疾病网络关系图

2.4 PPI网络的构建 为了更好地理解隐丹参酮联用三氧化二砷治疗胃癌的作用机制，基于PPI关系并使用STRING工具构建隐丹参酮联用三氧化二砷治疗胃癌相关靶点的PPI网络，见图4。PPI网络包含38个蛋白质节点，196条相互作用关系（连线），其中SCN5A与其他蛋白质节点无相互作用关系。通过R语言计算靶点的degree，并绘制barplot图，显示MAPK3、AKT1、APP、JUN、STAT3、EDN1、TNF、CCND1、MAPK1、RELA为排名前十的核心靶点，见图5。

图4 隐丹参酮联用三氧化二砷治疗胃癌相关靶点的PPI网络

图5 隐丹参酮联用三氧化二砷治疗胃癌排名前十的核心靶点

2.5 药物-疾病靶点GO分析 根据隐丹参酮联用三氧化二砷治疗胃癌相关的靶点进行GO分析，得到靶点具有的功能信息62条（P＜0.05），按P值选取前20条，见图6。结果发现，其功能涉及泛素蛋白连接酶结合、泛素样蛋白连接酶结合、抑制转录因子结合、G蛋白偶联的胺受体活性、突触后神经递质受体活性、乙酰胆碱受体活性、血清素受体活性、RNA聚合酶II特异的DNA结合转录因子结合等。

图6 隐丹参酮联用三氧化二砷治疗胃癌靶点的GO分析

2.6 药物-疾病靶点KEGG分析 以P＜0.05进行筛选，得到139条信号通路，按P值选取前20条，并按通路富集靶点个数排序。其中，前20条KEGG通路为TNF信号通路、细胞凋亡、神经活性配体-受体相互作用、cAMP信号通路、钙信号通路、糖尿病并发症中的AGERAGE信号通路、胆碱能突触、癌症中PD-L1表达和PD-1检查点途径等，表明隐丹参酮联用三氧化二砷的有效成分可能通过作用以上通路来治疗胃癌。其中，核心靶点RelA在TNF信号通路、细胞凋亡、cAMP信号通路等16条信号通路中均有涉及。见图7和表1。

表1 隐丹参酮联用三氧化二砷治疗胃癌潜在靶点的KEGG通路分析

图7 隐丹参酮联用三氧化二砷治疗胃癌靶点的KEGG分析

3 讨论

胃癌在全球范围内的发病率与死亡率居高不下，晚期胃癌患者的预后较差、生存期较短，严重威胁人类的生命健康［7］。近年来，中医中药治疗胃癌的优势逐渐凸显，是肿瘤精准化医疗发展、多靶点药物发现的源泉，而且蕴藏着巨大的新药创制资源［8］。中医学虽无“胃癌”之病名，但可归于“胃脘痛”“癥瘕”“积聚”“痞证”“脾积”等范畴。《诸病源候论》［9］曰：“血瘀于内，时时体热面黄，瘀久不消，则变成积聚癥瘕也”，《仁斋直指方论》［10］曰：“癌者上高下深，岩穴之状……毒根深藏，穿孔透里”。瘀为毒之基，毒为瘀之甚，瘀可蕴毒、毒复致瘀，最终导致瘀毒互结。张光霁教授认为胃癌病因病机复杂，往往交杂互结为患，核心病机为瘀毒互结，治宜化瘀攻毒、瘀毒同治。

丹参始载于《神农本草经》，具有活血化瘀、通经止痛等功效，多用于治疗癥瘕积聚、脘腹胁痛等疾病［11］。隐丹参酮由丹参的干燥根和根茎中提取而来，是丹参有效成分之一，是一种具有多种药理作用的天然喹诺酮二萜［12］。砒霜是以毒攻毒治癌中药的代表药，三氧化二砷是其主要活性成分。研究证实，隐丹参酮和三氧化二砷可用于胃癌等多种恶性肿瘤的治疗［13-15］，但具体作用机制不明。本研究旨在探讨隐丹参酮联用三氧化二砷治疗胃癌的具体分子作用机制，基于网络药理学理论采用TCMSP、Drugbank、GeneCards等工具筛选出隐丹参酮联用三氧化二砷治疗胃癌的潜在靶点共38个，分别为 MAPK3、AKT1、APP、JUN、STAT3、EDN1、TNF、CCND1、MAPK1、RELA等，涉及G蛋白偶联的胺受体活性、乙酰胆碱受体活性、G蛋白偶联的血清素受体活性、血清素受体活性、泛素蛋白连接酶结合、肽结合、泛素样蛋白连接酶结合、抑制转录因子结合等GO富集分析，涉及cAMP信号通路、TNF信号通路、细胞凋亡、神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路、癌症中PD-L1表达和PD-1检查点途径等炎症、代谢、免疫方面。

通过STRING和R语言工具筛选得到蛋白互作网络排名前十的核心靶点，RelA为其中之一。RelA虽为隐丹参酮的预测靶点，但通过隐丹参酮与三氧化二砷的联用，与16个靶点相互作用，并在排名前20的GO分析中参与了泛素蛋白连接酶结合、泛素样蛋白连接酶结合等6个GO过程，在排名前20的KEGG通路中参与了TNF信号通路、细胞凋亡等16条信号通路。RelA为核转录因子 -κB/p65（Nuclear Factor-kappa B/p65，NF-κB/p65），是最重要的功能亚基［16］，在人体胃癌组织中RelA核易位显著增高，NF-κB被激活。NF-κB是免疫应答与炎症反应中的一种重要调控蛋白，NF-κB的不适当激活与胃癌的发生、发展、浸润转移和化疗敏感性密切相关［17］。泛素化作用可影响蛋白质的稳定性和功能，从而调节广泛的细胞过程，泛素化机制的失调会导致胃癌等多种恶性肿瘤，RelA多个赖氨酸残基存在泛素化修饰，在肿瘤坏死因子受体相关因子7作用下促进泛素化，并进行溶酶体内降解，从而抑制NF-κB活性［18］，而隐丹参酮和三氧化二砷均可抑制NF-κB活化［19-20］。由此推测，隐丹参酮联用三氧化二砷治疗胃癌可能是通过靶向RelA，并促其泛素化，从而抑制NF-κB活化来实现的。

NF-κB抑制剂在临床上被广泛应用于胃癌的治疗，但由于NF-κB信号通路在机体内的交互性和复杂性，广泛抑制其活性会带来较多的不良反应，导致NF-κB抑制剂的临床疗效并不理想，这也促使着科研工作者去寻找更精准的NF-κB抑制剂。隐丹参酮联用三氧化二砷有可能成为精准治疗胃癌的新型药物，考虑到网路药理学工具的预测特殊性，本研究将在后续实验验证中夯实预测，为中医病机理论的临床应用实践提供科学的依据与参考。