观赏植物蓝色花形成的机制

李瀚纯，张大生，刘青青，刘凤栾，刘卓星,2，熊 磊,2，安向婕，田代科*

(1.上海市资源植物功能基因组学重点实验室/中国科学院上海辰山植物科学研究中心/上海辰山植物园，上海 201602；2.上海师范大学生命科学学院，上海 200234)

1 植物花青素类型概述

决定花瓣颜色的核心要素是花青素(Anthocyanidin)。花青素是存在于植物液泡中的水溶性色素，在细胞质中由位于内质网上的多酶复合体催化合成、修饰，并运输到液泡内贮藏[1]。花瓣组织一般包含表皮细胞、栅栏组织、海绵组织等。在大多数植物的花瓣中，使花瓣呈现色彩的花青素主要聚集在表皮细胞的液泡中，部分则存在于紧邻表皮细胞的一层栅栏组织细胞中[2]。花青素的结构是由一个基本的结构母核(2-苯基苯并呋喃阳离子)和不同的取代基组成，因取代基种类及位置不同而形成不同的花青素。天然花青素的生物合成途径总体上分为三大步骤，形成六种基本类型的花青素，分别是天竺葵色素(Pelargonidin)、矢车菊色素(Cyanidin)、芍药花色素(Peonidin)、飞燕草色素(Delphinidin)、矮牵牛花色素(Petunidin)和锦葵花色素(Malvidin)[3]。其中，天竺葵色素呈橙色或砖红色，矢车菊色素呈红色或品红色，而飞燕草类色素，包括飞燕草色素、矮牵牛花色素、锦葵花色素，对于蓝色花卉的形成至关重要[4]。

2 蓝色花卉形成的主要机制

研究表明，蓝色花卉的形成是多种因素共同作用的结果。许多基因工程案例证明，通过调控花瓣中蓝色色素表达量、改变核心色素结构母核的基团修饰、控制液泡内金属离子浓度、提高液泡 pH等手段，均可成功培育出蓝色花卉(表1)。

表1 蓝色花卉基因工程成功案例Table 1 Cases of genetic engineering leading to blue-petaled flowers

2.1 核心色素种类

首先花瓣中必须具有能够显蓝色的核心色素。自然界中大多数天然存在的蓝色色素，均由飞燕草类色素发展而来。飞燕草类色素包括飞燕草色素，及由飞燕草色素甲基化衍生而来的矮牵牛花色素和锦葵花色素。很多重要的观赏植物因不能生成飞燕草类色素而不具有蓝紫色花色。研究表明，在月季(Rosa hybrida)、菊花(Chrysanthemum morifolium)和康乃馨(Dianthus caryophyllus)等植物中能够通过引入飞燕草色素合成通路的关键酶基因F3′5′H(flavonoid-3′,5′-hydoxylase，类黄酮 3′,5′羟基化酶)使其花显现蓝色[5,8,12]。但是并非只有飞燕草色素及其衍生色素能够使花卉显蓝色，一些以其他色素为核心的色素复合体的出现也能导致蓝色花卉的形成，例如蓝色矢车菊(Centaurea cyanus)中天然存在一种特殊的四核金属复合物(Protocyanin)是以矢车菊色素为核心的[13]。喜林草(Nemophila menziesii)的金属花青素则是以矮牵牛花色素为核心的[14]。

2.2 花青素转运与积累

花青素苷的合成主要在内质网表面进行，作为花青素合成途径的最后步骤，花青素分子能否运输到液泡对于花色的呈现也至关重要。花青素分子运输到液泡中有三种方式：(1)以膜为介质；(2)以囊泡为介质；(3)以转运子为介质。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、葡萄(Vitis vinifera)和玉米(Zea mays)等植物中都有发现，谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-transferase，GST)在蓝色花色苷的运输过程中起作用，且该过程涉及到膜泡介导的运输作用。研究发现，花青素或者黄酮醇的衍生物能与谷胱甘肽(GSH)或谷胱甘肽转移酶结合，然后通过具有ATP结合域(ATP-binding cassette,ABC)的多药耐性相关蛋白(Multidrug resistance-associated protein,MRP)运输到液泡中[15—19]。由于液泡的体积非常大，在普通光学显微镜下不能甄别出未进行转移的花青素究竟处于细胞质还是细胞壁，目前的研究尚无法确定花青素在运输过程中的准确位置变化。但有证据表明，在玉米糊粉层细胞GST突变体bronze-2植株和液泡膜通道蛋白ZmMrp3基因沉默突变体植株中，所能检测到的花色苷类物质的总体含量相比于野生型都大幅降低。说明花青素在细胞质合成后能否运输到液泡影响到花青素在细胞中的含量[16]。在花卉中对这一运输模型的研究较少，因此运输系统与花卉的蓝色表型的形成有何关系尚无定论，Tanaka等[3]推测蓝色花会比红色花积累更多、更大、修饰更复杂的花青素分子，而红色花的运输系统与较大的花青素分子不兼容，从而导致不易形成蓝色花。

在一些植物中，花青苷运输至液泡后产生垛堞所形成的液泡内的二级结构被称作 AVIs(Anthocyanic vacuolar inclusions)。该结构能够将花青素与蛋白质紧密地富集在一起，尤其偏好富集双糖基修饰的花青素，该结构的形成能有效加深花色。在洋桔梗(Eustoma grandiflorum)的蓝紫色渐变品种中，呈现紫黑色的花瓣基部含有大量AVIs，而淡紫色的花瓣端部细胞仅含有少量的AVIs[20]。

2.3 花青素显色受环境影响

花色是否显蓝色并非单纯由核心花青素种类及其合成与运输来决定。花青素在自然条件下普遍发生修饰，通常以花色苷(Anthocyanin)的形式存在。花色苷可以与辅色因子发生辅助显色作用。辅色作用是指花色苷分子各修饰基团相互作用形成稳定结构，或花色苷与其他分子产生分子间相互作用辅助花色苷呈现特殊结构，从而影响花色表现。花青素结构母核中苯环上羟基活泼的化学属性使其容易发生基团修饰。通过分子相互作用，或受溶液成分和pH影响，修饰基团能轻易改变花青素原始的物理构象，从而影响花色的表现[21]。例如花青素芳香环的糖链与有机酸连接使花青素发生酰基化，花青素发生内部折叠形成稳定的“三明治结构”，有效阻止水对花青素色素环上羰基进行亲核加成以及一些其他的降解反应，使花青素分子能稳定显色[22—23]。花色的表现还受到金属离子和环境 pH的影响。在花瓣中天然存在的由花青素、类黄酮、金属离子通过分子间相互作用形成的金属花青素(metalloanthocyanin)能够很好地诠释这一观点。当金属花青素中的花青素与任何一种其他成分在体外溶液中混合，均不能表现出蓝色，只有在合适的 pH环境中按一定比例将所有分子混合，才能形成稳定的蓝色物质[24—25]。

2.3.1 花青素共价修饰

花色苷的分子内相互作用是指花色苷的生色基团上发生共价修饰，这些修饰基团与花色苷分子间的相互叠加作用共同阻止水的亲核加成，使花色维持稳定。这些修饰基团一般包括有机酸、其他黄酮类物质以及芳香酰基[21]。自然条件下游离的花色素极少见，常与一个或多个葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、 阿拉伯糖等通过糖苷键连接形成花色苷，花色苷母核结构上的羟基以及糖苷基上的羟基还可以与一个或几个分子的香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸等芳香酸和脂肪酸通过酯键形成酰基化的花色苷。此外花青素还能发生甲基化修饰。有研究认为该过程与细胞对杂环类外源物质的解毒过程非常相似，因为这两个过程都是在细胞质中发生，都是由各种酶针对疏水分子添加活性反应中心和亲水分子基团，如糖和有机酸，这类修饰一方面能增加该分子的水溶性，另一方面也能充当运输标记，被某类蛋白识别从而转运出细胞质[26]。还有研究认为，花青素的羟基化和有机酸基团修饰不仅能增加花色苷稳定性和在水中的溶解度，还能改变波长的最大吸收值，使花色变得更蓝[27—28]。花青素的修饰越多，修饰基团越大，其颜色越蓝[29]。风铃草(Campanula medium)和飞燕草(Consolida ajacis)花瓣天然显现的蓝色就是通过花青素上的有机酸修饰产生的。在飞燕草的白色突变体中，由于AA7BG-GT(Acyl-glucose-dependent anthocyanin 7-(6-(p-hydroxybenzoyl)-glucoside) glucosyltransferases)基因发生变异导致功能丧失，不能合成被高度修饰后呈现蓝色的飞燕草花色苷，从而导致白色突变体的形成[30]。智利蓝红花(Tecophilaea cyanocrocus) 的花瓣显蓝色与金属离子及分子间辅助显色作用均无关，其主要花色苷Tecophilin含有大量的修饰基团，通过分子内部相互作用形成 π-π平面结构使花色苷的光吸收谱向蓝色偏移[31]。若将龙胆(Gentiana scabra)的花青素糖基转移酶 Anthocyanin 5-O-glycosyltransferase (Gt5GT)、 Anthocyanin 3′-O-glycosyltransferase (Gt3′GT)，花青素酰基转移酶 Anthocyanin 5/3′-aromatic acyltransferase (Gt5/3′AT)编码基因敲除，花瓣的光吸收色谱会向红色偏移[32]。

2.3.2 分子间辅色作用

分子间的辅色作用主要指花色苷与其他不显色的类黄酮、苯丙烷类、类胡萝卜素等物质发生相互作用[33]。已知可以和花色苷产生辅色作用的化合物较多，如蛋白质、单宁酸、生物碱、类黄酮、黄酮醇、有机酸、核酸、多糖等[34]。Asen等[35]通过对众多有效辅色素的研究发现，可以和花色苷发生辅色反应的分子结构中都有一个显著的特征，即这些物质的分子中均有一个富含电子的π平面结构。当花青素与辅色素相互作用形成复合物，其吸收峰可以向长波方向移动至少35 nm，意味着花色向蓝色转变。在菊花中引入蝶豆花的 A3′5′GT(Anthocyanin 3′,5′-O-glucosyltransferase)基因，对飞燕草色素 B-环进行糖基化修饰，使形成的飞燕草花色苷(Ternatin C5)与类黄酮(Flavone 7-malonyl glucosides)互作从而呈现蓝色。若将飞燕草花色苷纯化后溶于花瓣细胞液，在pH 5.6条件下溶液却显示紫色，说明类黄酮起到辅助显色作用[8]。

2.3.3 金属离子

花色苷与金属离子络合能影响花色苷显色。某些花色苷具有邻位羟基结构，能与金属离子如钙、铁、铜、铝等形成配合物，使鲜花的颜色比花色苷本身的颜色鲜艳得多[34]。由花青素、类黄酮与某种金属离子络合的复合体被称为金属花青素[24]，在许多蓝色花卉中都能发现这样的花青素存在形式，如Kondo等[36]在蓝色鸭跖草(Commelina communis)中发现鸭跖草苷(Commelinin)，Takeda[37]在蓝色鼠尾草(Salvia patens)中发现原飞燕草苷(Protodelphin)。在金属花青素中，Mg2+容易与飞燕草类色素络合形成蓝色物质，而 Fe3+易与矢车菊类色素形成蓝色复合物[13,38—39]。与花青素在液泡中形成络合物的金属离子是由位于液泡膜上的金属离子运输载体转运的。在郁金香液泡膜上的铁离子运输载体TgVit1将铁离子富集在液泡中并与飞燕草花色苷形成稳定的配合物，使花瓣呈现蓝色[40]。八仙花(Hydrangea macrophylla)在酸碱性不同土壤中的变色现象就是由铝离子参与的花色苷络合导致的，在酸性条件下，植物根系主动分泌有机酸激活铝离子运输通道，促进根系对铝离子的吸收[41]。位于花瓣细胞液泡膜上的HmVALT (H.macrophylla vacuolar aluminum transporter)和位于花瓣细胞质膜的 HmPALT1 (H.macrophylla plasma membrane-localized aluminum transporter)铝离子运输载体从细胞外液中将铝离子吸收并富集到液泡内，与飞燕草花色苷形成络合物，使花瓣显现蓝色[42]。有证据表明该过程可能与DNA甲基化有关[43]。使用外源硫酸铝对八仙花进行处理，能够诱导HmVALT和HmPALT1基因表达量增加，促进铝离子和飞燕草花色苷在花瓣中积累[44]。

2.3.4 环境pH

植物细胞液泡 pH的改变与许多生理过程密切相关，如细胞吸水膨大、物质转运、离子平衡等[45]。由于在不同 pH环境下花青素发生色谱迁移能使花朵颜色改变，液泡 pH改变对传粉者的选择也会产生影响[24]。体外试验中，环境pH较低时(pH≤3)，花色苷主要以红色、橘色或者紫色的阳离子(Flavylium cation)形式存在；当pH为3～6时，花色苷阳离子同时发生水合反应与质子转移反应，前者主要产物是无色的甲醇假碱(Carbinol pseudobases)和黄色的查尔酮假碱(Retro-chalcones)，后者的主要产物是紫色的醌式碱(Quinonoid anions)；当 pH为6～7时，花色苷以紫色或浅紫色稳定的醌式碱形式存在；当pH上升至8～10时，主要以蓝色离子化的醌式碱形式存在。在高pH下花色素趋向不稳定，在原花青素的基础上衍生出更多的分子形式[34,46]。在植物体内，蓝色作为花青素经过反复修饰与折叠的特殊的色谱迁移现象，也在很大程度上受到液泡pH的影响。大部分蓝色花卉的核心色素都是从飞燕草花色素衍生而来，也有少部分蓝色花卉的核心色素是矢车菊色素、矮牵牛花色素或芍药花色素，比如以芍药花色素为基础的牵牛花核心色素HBA(‘Heavenly Blue’ anthocyanin)。含有这种花青素的牵牛花(Ipomoea tricolor)，在开放前(-24 h)其液泡pH为6.6，花瓣为红色，而开放第一天(0 h)液泡pH升高至7.7，花瓣显蓝色。在这期间花青素组成成分没有任何改变，并且色素上的残基也未产生同分异构体，因而推测HBA能在pH的影响下呈现独特的垛堞形式，表现不同的色彩。相比于碱性环境，HBA或许在偏酸性的环境中更加不稳定，从而影响到HBA的空间折叠方式，并使色谱向红色迁移[24]。

pH对花色的调控是一个复杂的过程。尽管不同物种花瓣碾碎后匀浆之间的 pH差异微乎其微，但同一物种花瓣中不同类型细胞之间的 pH差异却很大，在牵牛花中花瓣表皮细胞 pH明显高于花瓣内层细胞pH[47]，且花瓣表皮细胞液泡中的pH调控方式与其他组织细胞的液泡 pH调节机制不同,如在矮牵牛花瓣中调控液泡pH的PH1、PH5基因在花药、萼片、茎、叶中则不表达[47—48]。液泡的pH是通过位于液泡膜上的质子泵向液泡内或向细胞质内转运质子来调控的。目前为止，影响花瓣液泡 pH的基因研究主要针对两大基因家族，分别是编码定位在液泡膜上的P-ATPase质子泵(Proton pump)及其上游调控因子的 PH基因家族，和编码定位在液泡膜上的 NHX阳离子/质子双向运输泵(Proton antiporter)的NHX基因家族。P-ATPase在调节跨膜H+浓度梯度及不同膜系统内部 pH方面具有重要作用，NHX则最早发现于具有耐盐功能的植株中。

在牵牛花蓝色品种(Ipomoea tricolor cv.Heavenly Blue)开放过程中，人们观察到一种普遍现象——从花苞显色到花朵完全盛开，花色经历了从紫红色到蓝色的转变，同时伴随着花瓣 pH升高的现象[47]。2001年，日本Toshio团队采用微电极直接探入日本牵牛花(Ipomoea nil 或 Pharbitis nil)花瓣表皮细胞和其中液泡，通过电流精确记录到表皮细胞中细胞液和液泡内 pH存在差别。进一步证明花瓣 pH升高与花瓣转变为蓝色有密切联系。随后他们通过原位杂交发现液泡膜上负责质子/阳离子交换的运输泵编码基因 InNHX1 (Na+/H+exchanger isoform 1)与蓝色的形成有关[49]。2005年，另一日本科学家Yoshida团队对Ipomoea tricolor cv.Heavenly Blue 的ItNHX1蛋白质定位和功能进行了进一步探索。通过制备开花过程中不同时段不同部位的质膜碎片并进行免疫印迹实验发现，NHX1分子质量约50 kD，在花瓣有色组织中特异表达，且开花前表达水平极低，而在开花后(0 h)表达显著上升，这和Toshio的定量结果高度吻合。该团队同时也对Vacuolar H+-ATPase(V-ATPase)，H+-pyrophosphatase(V-PPase)和 Plasma Membrane H+-ATPase(PM-ATPase)这三个调控液泡和细胞质pH的重要质子运输泵进行免疫印迹实验，结果表明，在开花过程中，V-ATPase表达量基本保持一致，V-PPase的表达量在开花时(0 h)显著升高，PM-ATPase表达量则呈现逐渐上升趋势。在开花阶段(0 h)这三者的表达量都远远低于NHX1，且NHX1的表达具有明显的阶段特异性和组织特异性，再次证明其与开花过程中花色的急剧转变具有直接的联系。此外，在分离原生质体时发现蓝色的成熟花瓣表皮细胞原生质体的体积大约是红色花蕾期花瓣表皮细胞原生质体的二倍，说明开花的过程伴随着大量水分渗入液泡，这个过程与开花时液泡 pH升高之间的关系尚未得到阐明[50]。

P-ATPase出现的时间早于被子植物，即在有花器官产生之前，P-ATPase已经在植物中被用于质子的运输。P-ATPase最早被发现定位在细胞质膜上，而液泡膜上负责运输质子的是 V-ATPase和V-PPase，后来P-ATPase(PH1,PH5)被发现也存在于矮牵牛花瓣表皮细胞的液泡膜上，参与液泡的酸化作用。蛋白质序列比对显示，PH1、PH5与细胞膜上P-ATPase具有较高同源性，推测液泡膜上的这两个 P3A/3B-ATPase质子泵来源于早期细胞质膜上P-ATPase的编码基因复制现象，原来定位于细胞质膜的 P-ATPase发生了 N-端多肽修饰，导致蛋白质分选的目的地发生改变[51]。矮牵牛花瓣表皮细胞液泡pH值受到7个PH基因调控：PH1编码蛋白属于P3B-ATPase家族，在液泡膜上具有质子运输活性；PH3编码一个WRKY蛋白；PH4编码MYB转录因子，在大豆(Glycine max)的蓝色花突变体中PH4基因单碱基突变造成翻译提前终止，使包括PH5在内的多个下游液泡酸化相关基因的表达下调[52]；PH5编码蛋白属于P3A-ATPase家族，不能独自进行质子运输，能够辅助增强PH1的质子运输活性；PH6(AN1)编码蛋白与PH3、PH4、AN11互作，其表达与液泡内质子浓度升高呈正相关。PH1、PH5的表达在葡萄果实和月季叶中也能被检测到，说明 PH1、PH5并非具有花瓣花青素辅助显色这一单一功能的液泡结构蛋白[53—54]。2017年Faraco团队发现PH1还具有在矮牵牛含色素花瓣表皮细胞中介导膜泡(Vacuolino)与中央大液泡融合的功能[55]。这类基因的其他功能与植物发育的关系尚未完全得到阐明。相比于细胞膜上的 P-ATPase编码基因出现的时间之长、覆盖物种范围之广，该基因在蓝色花卉的形成和对传粉者的吸引方面的作用仅是近年才被关注。PH1、PH5基因在成花早期现蕾时在花瓣表皮细胞中就具有较高的表达量。在玫瑰中，PH1、PH5表达模式与花色的加深出现较高的时期一致性，或许是由于其与花色素合成酶基因均受到 MYB转录因子复合体的调控[51]。

与矮牵牛中控制液泡pH的PH基因家族不同，InNHX1不受花色苷合成通路的转录因子调控。矮牵牛PhNHX1基因在花发育的各个时期表达模式基本没有差别，说明造成矮牵牛和牵牛花开花过程中颜色变化的两类基因没有相关性。此外，在NHX1基因控制下的牵牛花液泡pH水平可升高至8.0，而在PH基因控制下的矮牵牛液泡 pH水平最高仅达5.8～6.2。除PH基因家族和NHX基因家族以外，在欧洲报春(Primula vulgaris)中发现的由PvPH4基因编码的液泡钙离子转运体(Vacuolar cation/proton exchanger,CAX)与报春花花瓣细胞液pH也具有很强的相关性，推测蓝色报春花的花瓣细胞液 pH较高是受PvPH4高表达的影响[56]。

3 展望

综上所述，越来越多的实验证明在天然存在的花瓣显色系统中存在复杂的分子间作用，这种作用使花瓣即使在非常低的液泡 pH环境中也能够显示蓝色，因此任何能使核心色素分子花青素呈现特殊结构的分子育种手段都应该在蓝色花分子育种中得到重视。为了培育蓝色花卉，需要研究的基因不仅涉及花青素合成途径中的关键酶基因，还需要关注的基因有：(1)花青素的修饰基因。只要花青素上有大量的修饰基团，吸收波长向长波段移动，花色向蓝色转变，例如不显蓝色的芍药花色素被高度修饰后也能使花瓣呈现蓝色。(2)通过分子间作用影响花青素结构的相关基因。花色素结合的辅色素、金属离子在不同的物种花瓣之间是高度特异的，为培育某一物种蓝色花卉，必须聚焦到该物种花瓣内所形成的花色素复合体上。(3)能使液泡pH升高的基因。(4)花青素运输相关基因等。