不同采收期雷公藤甲素测定及其动态积累

袁玉虹，孙 艳，郑郁善*

(1.福建林业职业技术学院，福建 南平 353000；2.福建农林大学，福建 福州 350002)

雷公藤(Tripterygium wilfordii)又名断肠草，为卫矛科雷公藤属攀缘藤本植物，是我国传统的中药材，具有祛风除湿、活血通络、消肿止痛、杀虫解毒之功效[1]。雷公藤制剂在临床上常用于治疗自身免疫性疾病，如类风湿关节炎、肾炎、接触性皮炎及系统性红斑狼疮等[2]。雷公藤分布区域较为广泛，主要分布于我国长江流域和西南地区，如浙江、安徽、湖南、湖北、福建、广东、广西、云南等省区。近年来，雷公藤种植已成为福建山区主要脱贫致富途径之一。

雷公藤的主要活性物质为雷公藤甲素(Triptolide，C20H24O6)，又名雷公藤内酯醇。雷公藤甲素药用价值较高，具有抗肿瘤、调节免疫系统、抗生育等作用[3]。但其毒性大，临床应用中治疗量和中毒量非常接近，安全范围小，剂量稍高其毒副作用则超过活性作用，因此雷公藤甲素含量是其重要的质量指标[4]。目前，国内外对雷公藤的研究多集中在育苗、栽培、良种选择、组织培养等方面[5—10]，其临床医学应用、化学成分及测定[11—18]等方面也有较深入研究，而雷公藤甲素含量在不同采收期及各入药部位的动态变化尚未报道。

本实验以种植5年的雷公藤为试材，对其不同采收期内各入药部位雷公藤甲素含量的动态规律进行分析，为雷公藤人工采收、质量评价和资源开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

LC-20AD液质联用仪(日本岛津仪器公司，SPD-20A紫外可见双波长检测器，SIL-20A自动进样器，CTO-20A柱温箱，CBM-20A系统控制器，LC solution工作站)，色谱柱(SinoChrom ODS-BP 5 μm，200 mm×4.6 mm)，旋转蒸发仪(R-201，上海申胜生物技术有限公司)，数控超声波清洗器(KQ-250DE，昆山市超声仪器有限公司)，电子分析天平(CP214，奥豪斯仪器有限公司)。

1.1.2 试剂

雷公藤甲素标准品(中国药品鉴定研究所，批号111567-201602)，色谱甲醇(德国 MERCK)，色谱乙腈(德国MERCK)，中性氧化铝(200～300目)，超纯水，甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、无水乙醚均为国产分析纯。

1.1.3 药材

雷公藤为5年生成熟植株，样品均采自福建省泰宁县雷公藤规范化种植基地福建杉阳雷公藤产业发展有限公司，共收集6批不同采收期的雷公藤根、茎与叶部位(表1)。

表1 雷公藤样品采集时间Table 1 Different collection time of Tripterygium wilfordii samples

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液配制

称取雷公藤甲素对照品适量，加乙腈溶解并定容至10 mL容量瓶中，溶液用0.45 µm微孔膜过滤，作为对照品溶液。

1.2.2 供试品溶液配制

精密称量雷公藤样品粉末(过60目筛) 2 g于锥形瓶中，用80%甲醇溶液按料液比1:35浸提24 h，超声处理35 min。用25 mL氯仿萃取3次，将所得膏状物置于氧化铝层析柱洗脱，旋转蒸发洗脱液至干，残渣用甲醇溶解并转移至10 mL容量瓶中。加甲醇至刻度线，摇匀，过滤，转入样品瓶待测，即得供试品溶液。

1.2.3 色谱条件

色谱柱为SinoChrom ODS-BP；流动相为甲醇-水(45:55)；流速1.0 mL·min-1；检测波长218 nm；柱温40 ℃。取供试品溶液20 μL进行测定。

1.2.4 标准曲线绘制

分别从浓度为500 μg·mL-1标准液，依次倍比稀释浓度为 250 μg·mL-1、125 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1、31.25 μg·mL-1、15.625 μg·mL-1，在“1.2.3”色谱条件下进样检测，以雷公藤甲素对照品浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.5 精密度试验

取同一浓度的雷公藤甲素标准品溶液，连续进样6次，记录各次的峰面积，计算RSD值。

1.2.6 稳定性试验

取同一雷公藤样品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12 h依次进样记录峰面积，计算RSD值。

1.2.7 重复性试验

精密称量 5份雷公藤样品粉末 2.0 g，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，在“1.2.3”色谱条件下进样检测，记录峰面积，计算RSD值。

1.2.8 回收率试验

精密称量6份雷公藤样品粉末，分别加入适量的雷公藤甲素对照品，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，在“1.2.3”色谱条件下进样检测，测得雷公藤甲素含量，计算回收率和RSD值。

1.2.9 样品含量测定

取6批次采收期雷公藤样品，精密称量各批次雷公藤样品根、茎、叶粉末2.000 g，平行称样3次。按“1.2.2”方法制备供试品溶液，并在“1.2.3”色谱条件下进样测定，记录峰面积，计算雷公藤甲素含量。

2 结果与分析

2.1 色谱条件及适应性试验

由图1、图2可知，雷公藤样品中雷公藤甲素与其他成分分离效果良好。在“1.2.3”色谱条件下，雷公藤甲素的保留时间为10.52 min，已达到基线分离，分离度大于 1.5，理论板数大于 5000。结果表明，该方法在测定雷公藤甲素含量时具有良好的系统适应性。

图1 雷公藤甲素对照品色谱图Fig.1 Chromatogram of triptolide reference substance

图2 雷公藤样品中甲素色谱图Fig.2 Chromatogram of triptolide in the sample of Tripterygium wilfordii

2.2 标准曲线

在“1.2.3”色谱条件下进行雷公藤甲素对照品定量测定，记录雷公藤甲素的色谱峰保留时间及峰面积。以对照品浓度为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，即 Y=0.0115X+1.3594(R2=0.9997)。结果表明雷公藤甲素的浓度在 7.75～250 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.3 精密度考察

按照“1.2.5”方法，取同一浓度雷公藤甲素标准品溶液，连续进样6次，每次进样20 μL，记录每次进样峰面积，计算峰面积平均值，得出RSD值为1.13%，表明仪器精密度良好，符合测定要求。

2.4 稳定性考察

按照“1.2.6”方法，取同一雷公藤样品溶液，在12 h内每间隔2 h测定一次，记录峰面积，其RSD值为1.07%，表明供试品在12 h内稳定性良好。

2.5 重复性考察

按照“1.2.7”方法，平行制备5份供试品溶液，测定并记录峰面积，计算RSD值为0.98%。表明该方法重复性良好。

2.6 回收率考察

按照“1.2.8”方法，制备6份供试品溶液，测定并记录峰面积，计算加样回收率和RSD值。结果显示，雷公藤加样回收率为 99.21%，RSD值为1.578%(表1)，表明该方法回收率较好。

表2 回收率试验结果Table 2 Test results of recovery rates

2.7 雷公藤甲素含量的动态变化

由表3可以看出，采收时间对雷公藤根和叶的甲素含量有显著影响，对雷公藤茎的甲素含量的影响不显著。雷公藤整个生长周期中，7～8月雷公藤叶片中甲素含量最高，其次是根部，含量最少的为茎部；11～12月根部甲素含量最高，其次是叶片，甲素含量最少的仍为茎部。就雷公藤全年采收量各部位雷公藤甲素含量的总和而言，雷公藤叶片甲素的含量略高于根部，具有资源开发利用潜力。

表3 不同采收期雷公藤不同入药部位的甲素含量(μg·g-1)Table 3 Contens of different harvesting periods of triptolide in different parts of Tripterygium wilfordii (μg·g-1)

3 讨论

研究发现，雷公藤茎叶中含有大量的雷公藤甲素，因此，从资源利用角度讲，可以将茎叶作为提取雷公藤甲素的生产原料[19]。孙乙铭等[16]、倪乐[20]研究发现，在不同套种模式下，雷公藤各部位甲素含量由高到低依次为根、叶、茎。但本研究显示，不同采集部位和不同采收期下雷公藤甲素含量存在一定差异，在实验周期内，雷公藤甲素不同部位含量高低依次为叶、根、茎，可能是叶作为植物生长的重要营养器官，其代谢能力比根部旺盛，因此雷公藤叶片甲素含量较高。

本研究发现，雷公藤叶片甲素含量最高为7～8月，达 24.08 μg·g-1，11～12 月最低，为 15.44 μg·g-1，翌年又开始逐渐上升。一般7～8月雷公藤叶片光合作用强，代谢旺盛，可能产生并积累了大量甲素；11月至翌年1月雷公藤叶片开始枯萎，代谢减弱，温度降低，导致叶片甲素含量降低，翌年3月雷公藤开始长新叶，代谢增强，叶片甲素含量又逐渐上升。雷公藤根部甲素含量在 11～12月最高，达21.71 μg·g-1，这一时期雷公藤地上部分停止生长，繁殖器官营养消耗大，导致茎、叶的活性成分转移至根部，使根中甲素含量增加。这与斯金平等[21]报道的雷公藤体内雷公藤甲素质量分数在冬季至初春季最高基本一致。但在整个采收期内雷公藤茎中甲素变化不大。

本研究探讨了雷公藤甲素在不同采收期植物体内积累的动态变化过程，建议生产中每年在7～8月采收雷公藤地上部分(茎叶)，11～12月采收雷公藤地下部分(根)，用于雷公藤甲素提取。