氢氧化钠增强雷帕霉素抑制Tsc2缺失的小鼠胚胎成纤维细胞的增殖

李 凯，王亚南

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生理学系，北京 100005)

结节性硬化症(tuberous sclerosis complex, TSC)是一类影响全身多器官的遗传病，疾病表现为患者的肾脏、脑、皮肤、心脏等器官可自发形成肿瘤，并常伴随有神经方面疾病如癫痫，等等。TSC1/2缺失或突变导致的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)过度活化是TSC的主要发病机理。目前TSC患者的治疗主要是通过长期服用mTOR抑制剂——如西罗莫司和依维莫司——抑制mTOR活性，进而控制如自发瘤的形成等病症的进展[1]。

mTOR信号通路在肿瘤的发生发展中一直扮演着一个重要的角色。由于mTOR可以通过多种方式感应并整合激素、葡萄糖、氨基酸等多种信号，进而调控细胞的增殖、分化、自噬、能量代谢和蛋白合成等多种细胞必不可少的生命过程[2]。因此，肿瘤的发生发展与该通路有着密切关系。

多数肿瘤细胞处于一种代谢异常状态，即便在有氧状态下也会以糖酵解作为主要供能手段，这称之为“瓦博格效应(Warburg effect)”。有氧糖酵解带来的影响之一是细胞内乳酸的堆积。堆积的乳酸通过细胞排出，导致肿瘤微环境pH值下降[3]。前期研究发现，mTOR通过上调PKM2的表达促进肿瘤细胞的有氧糖酵解[4]，所以mTOR的过度活化与细胞的异常代谢以及细胞外pH降低有所关联。而肿瘤的酸性微环境为肿瘤的发生发展提供多种便利，包括增加其侵袭转移能力等[5-6]。调节肿瘤的酸性微环境已经被证实有利于肿瘤的治疗[7-8]。

由于在TSC与肿瘤中均有mTOR过度活化的情况，而调节酸性环境有利于肿瘤的治疗。一个值得探讨的问题就是调节酸性环境是否有利于TSC的治疗。

因此，本研究利用Tsc2缺失(Tsc2-null,Tsc2-/-)小鼠的胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)来建立TSC的细胞模型，模拟TSC患者细胞中mTOR过度活化的状态；通过改变细胞所处微环境的酸碱度，研究其对雷帕霉素的敏感程度的变化，以期为TSC的治疗提供一个新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：Tsc2-/-小鼠胚胎成纤维细胞系(Tsc2-/-细胞)及其对照的野生型细胞系(wildtype, WT细胞)(本实验室保存，参照已有描述[9])。

1.1.2 主要试剂：DMEM-高糖培养基(Corning公司)；胎牛血清和EDTA-0.25% 胰蛋白酶(Gibco公司)；噻唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)(Ameresco公司)；氢氧化钠(NaOH)(北京化工厂)；雷帕霉素(rapamycin，Rapa)和羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)(Sigma-Aldrich公司)；多聚甲醛和结晶紫(武汉塞维尔公司)；细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(上海翊圣生物科技公司)；β-actin 抗体(Santa Cruz公司);核糖体蛋白S6抗体、磷酸化核糖体蛋白S6(Ser235/236) 抗体、磷酸化4E-BP1(Thr37/46) 抗体(CST公司)；山羊抗小鼠和山羊抗兔荧光IgG二抗(LI-COR公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养：将Tsc2-/-细胞及WT细胞培养于含10 mmol/L HEPES和10% 胎牛血清的DMEM-高糖培养基中，放置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。光学显微镜下观察细胞汇合度达到90% 时，利用EDTA-0.25% 胰蛋白酶消化并传代。

1.2.2 实验的分组：将Tsc2-/-细胞及WT细胞分为：对照组、氢氧化钠(15 μmol/L NaOH)处理组、雷帕霉素(10 nmol/L Rapa)处理组、氢氧化钠和雷帕霉素联合(15 μmol/L NaOH + 10 nmol/L Rapa)处理组。各组药物浓度均为终浓度。对照组与Rapa组培养基的pH值为7.4;NaOH组和Combo组培养基的pH值为8.4。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖：将Tsc2-/-细胞及WT细胞培养于96孔板，每孔接种2 000个细胞，分别在药物处理0、24、48、72 h后加入MTT，每组每个时间点各设置5个复孔，检测各孔在570 mm波长的吸光度(A)值，经过计算后获得各个时间点的差异倍数(fold change)并绘制生长曲线。

1.2.4 克隆形成实验：将Tsc2-/-细胞及WT细胞各300个接种于6孔板中，充分分散后按照药物分组处理7 d。在光学显微镜的100倍视野下看到单个群落填充满视野后，经多聚甲醛固定，使用结晶紫染色，之后拍照、计数。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期：细胞经药物处理24 h后，胰蛋白酶消化，用预冷的70% 乙醇固定，进行碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色，通过C6流式细胞仪检测细胞所处周期的比例，用FlowJo软件进行数据分析。

1.2.6 免疫印迹法检测蛋白：细胞培养在6孔板中，按照分组给予药物处理48 h后提取蛋白，进行SDS-PAGE、转膜和封闭。加入对应一抗后4 ℃过夜。第2天加入二抗，室温孵育2 h。在Odyssey CLX双色红外激光成像系统中显影，并获取图像。利用Fiji软件测算图像上条带的灰度值，进而计算蛋白相对表达量(以β-actin为内参)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 氢氧化钠联合雷帕霉素抑制Tsc2-/- 细胞的增殖

在NaOH组中，Tsc2-/-细胞的增殖能力显著低于对照组(P<0.05)。在Rapa组中，WT细胞和Tsc2-/-细胞的增殖能力均显著低于对照组(P<0.05)。在Combo组中，WT细胞和Tsc2-/-细胞增殖能力显著低于NaOH组和Rapa组(P<0.05)。在Rapa组和Combo组中，Tsc2-/-细胞的增殖能力显著低于WT细胞(P<0.05)(图1)。在NaOH组和Rapa组中，WT细胞和Tsc2-/-细胞的克隆形成数量均显著低于对照组(P<0.05)。在Combo组中，WT细胞和Tsc2-/-细胞的克隆形成数量显著低于NaOH组和Rapa组(P<0.05)。在Rapa组和Combo组中，Tsc2-/-细胞的克隆形成数量显著低于WT细胞(P<0.05)(图2)。

A.growth curves of WT and Tsc2-/- cells in different treatments; B.fold change of 72 hours comparing to 0 hour in same cell line with different treatments; *P<0.05 compared with control group in same cell line; #P<0.05 compared with Rapa group in same cell line; △P<0.05 compared with NaOH group in same cell line; ▽P<0.05 compared with WT cells in same treatment

A.photos of colony formation of Tsc2-/- and WT cells in different treatments; B.bar chart represents the number of colonies in different treatments and cell lines; *P<0.05 compared with Control group in same cell line; #P<0.05 compared with Rapa group in same cell line; △P<0.05 compared with NaOH group in same cell line; ▽P<0.05 compared with WT cells in same treatment

2.2 氢氧化钠联合雷帕霉素阻滞Tsc2-/-细胞增殖周期

与对照组相比，在NaOH组和Rapa组中，仅Rapa组的WT细胞和Tsc2-/-细胞的G1期比例升高 (P<0.05)。Combo组的WT细胞和Tsc2-/-细胞的G1期比例显著高于NaOH组和Rapa组 (P<0.05)。在Combo组中，Tsc2-/-细胞的G1期比例显著高于WT细胞 (P<0.05)(图3，表1)。

表1 氢氧化钠联合雷帕霉素将Tsc2-/-细胞阻滞在G1期

Flow cytometric analysis of cell cycle in treated Tsc2-/- and WT cells

2.3 氢氧化钠不降低mTOR通路中p-S6和p-4EBP1的表达

与对照组相比，Rapa组的WT和Tsc2-/-细胞的p-4EBP1和p-S6蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。NaOH组WT细胞的p-4EBP1和p-S6蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与NaOH组和Rapa组相比，Combo组的p-4EBP1和p-S6蛋白表达水平只显著低于NaOH组(P<0.05)(图4)。

A.Western blot was used to analyze S6, p-S6 and p-4EBP1 expression levels in Tsc2-/- and WT cells; B-D.relative protein expression levels of S6 (B), p-4EBP1 (C), and p-S6 (D); *P<0.05 compared with control group in same cell line; △P<0.05 compared with NaOH group in same cell line

3 讨论

结节性硬化症(TSC)是一种常染色体显性遗传病，6 000～10 000名新生儿中就有1位患儿，约90% 的患者伴随着TSC1/2基因突变。目前一种有效疗法是长期服用雷帕霉素衍生物如西罗莫司和依维莫司，来抑制TSC1/2失活突变导致的mTOR过度活化[1]。在依维莫司的临床实验中，治疗TSC患者血管肌脂瘤的有效率是42%[10]。而在使用依维莫司辅助治疗TSC患者癫痫的临床实验中，有效率则在40% 以下[11]。这表明雷帕霉素的抑制效果依然有限， 并且尚无能有效替代雷帕霉素的疗法。因此需要找到新的一种疗法，以增强雷帕霉素的作用。

细胞代谢改变是肿瘤细胞异于普通细胞的重要特征之一，大多数肿瘤会产生“瓦博格效应”，导致肿瘤微环境的pH下降。且酸性的肿瘤微环境促进了肿瘤的发生发展[5]。前期研究表明，Tsc2缺失导致的mTOR过度活化会上调PKM2的表达，促进“瓦博格效应”的产生[4]。中和肿瘤的酸性微环境可明显降低肿瘤的恶化程度，减少侵袭转移[7]，并可改善肿瘤免疫微环境，有利于肿瘤的治疗[8]。

那么可否将调节酸性微环境的疗法应用于治疗mTOR过度活化的TSC患者呢？本研究发现，碱性环境(pH 8.4)中的雷帕霉素能够有效抑制Tsc2-/-细胞增殖能力。这一结果提示在TSC的细胞模型中，升高细胞外pH值可以增强其对雷帕霉素的敏感性。前期报道表明，雷帕霉素可以使细胞周期阻滞在G1期[12]。本研究发现碱性环境(pH 8.4)中的雷帕霉素可以进一步将细胞周期阻滞在G1期，暗示碱性环境或许通过调节细胞周期来发挥作用。

雷帕霉素控制TSC疾病进程的分子机制是抑制mTOR过度活化。而p-S6和p-4EBP1是mTOR通路下游的标志性分子，其表达高低可以反映mTOR活性的强弱[2]。本研究显示，Combo组和Rapa组相比，p-S6和p-4EBP1的表达量并无明显改变。这表明氢氧化钠并不影响雷帕霉素对mTOR通路的抑制作用。

综上，碱性环境(pH 8.4)可在不影响雷帕霉素对mTOR信号通路作用的情况下，增强其抑制细胞增殖的效果。在未来的临床应用中，或许可以联合使用靶向酸性环境的药物，在维持现有效果的同时，降低雷帕霉素的剂量，进而减少如免疫抑制、伤口愈合障碍等剂量相关的不良反应，提高患者的生活质量。