活血消癥益气方对肝硬化模型大鼠肝功能与血管内皮功能及炎性因子的影响

吴晓玲，李力强，吴伟斌，张贵锋，杨 坚

（广东省肇庆医学高等专科学校，广东 肇庆 527400）

肝硬化（hepatic cirrhosis，HC）是各种病因长期作用于肝脏，引起肝脏弥漫性纤维化、假小叶形成、肝内外血管增殖为特征的病理阶段，随病情进展可出现腹水、门静脉高压、肝性脑病、肝衰竭等并发症，可进展为肝细胞癌，每年约有100万肝硬化患者死亡［1］。肝硬化诊断明确后，应尽早开始综合治疗。病因是治疗的关键，必要时抗炎抗肝纤维化，积极防治并发症［2］。《肝硬化诊治指南》（2019版）认为，在抗肝纤维化治疗中，目前尚无抗纤维化西药经过临床有效验证，而中医中药发挥了重要作用［3］。鳖甲消癥丸是广东省名中医李力强教授发明的一种治疗肝病的中药院内制剂（粤药制字Z20070356，ZL20150670167.3），具有活血消癥益气之功，并在临床实际应用了30余年。研究表明该药能有效抗肝纤维化和改善肝炎患者肝功能［4］，为探索其作用靶点和疗效机制，进一步提高临床疗效，课题组观察了活血消癥益气方（鳖甲消癥丸原方）中药配方颗粒剂对肝硬化模型大鼠肝功能、血管内皮功能及炎性因子的影响，报道如下。

1 材 料

1.1 实验动物

选择SD大鼠50只［湖北省疾控中心动物实验中心提供，实验动物许可证号SYXK（鄂）2017-0065］为实验对象，雌雄各25只，适应性饲养1周，随机分为空白组10只，造模组40只。造模成功后的大鼠32只，随机分为模型组、吡非尼酮、鳖甲煎丸、活血消癥益气方组，每组8只。空白对照组8只入组观察。

1.2 药物与试剂

中药配方颗粒（批号1808001w，华润三九医药股份有限公司生产）、鳖甲煎丸（国药准字Z42020772，国药集团中联药业有限公司生产）、吡非尼酮原料药粉（货号EB03028，购于上海士锋生物科技有限公司），高脂饲料（购自湖北省疾控中心动物实验中心），四氯化碳（货号C805332，购自上海麦克林生化科技有限公司），谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、总胆红素（TBil）检测试剂盒（货号C010-2-1、C009-2-1、A045-2-2、A028-2-1、C019-1-1，购自南京建成生物工程研究所），总一氧化氮（NO）检测试剂盒（货号S0021，购自上海碧云天生物技术有限公司），内皮素-1（ET-1）、血管内皮生长因子（VEGF）ELISA试剂盒（货号TLE0560R，购自广州天元生物科技有限公司），肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）ELISA试剂盒（货号SEKR-0009，深圳市达科为生物工程有限公司生产）。

2 方 法

2.1 动物造模

参考相关文献采用四氯化碳复合法诱导造模［5］：造模组大鼠给予高脂饲料加5%食用白酒溶液（50度白酒加蒸馏水稀释而成）进行饲养，空白组用普通饲料及蒸馏水进行饲养。第1～2周按0.2mL/100g体质量给予造模组40%（v/v）的四氯化碳橄榄油溶液灌胃，第3～12周按0.2mL/100g体质量给予造模组50%（v/v）的四氯化碳橄榄油溶液灌胃，每周一、周四各给药1次。空白组给予等量的橄榄油溶液。每周一大鼠称重1次，每周给药剂量根据体质量调整。在第12周末，随机选择正常组、造模组大鼠各2只，乌拉坦麻醉后，下腔静脉取血检测大鼠血清AST、ALT含量，观察大鼠肝脏肿胀度，取肝组织进行HE染色及Masson染色。对比空白组及造模组指标，确定造模是否成功。

2.2 干预方法

大鼠每日给药剂量参考《药理实验方法学》进行换算。

吡非尼酮组按照120mg/kg剂量给予吡非尼酮原药粉进行灌胃干预治疗。

鳖甲煎丸组按照0.9g/kg剂量给予鳖甲煎丸灌胃干预治疗；用小量温水将药物研磨为混悬液，加入适当体积的温水配置为灌胃液，再按照1mL/200g体质量灌胃。

活血消癥益气方组给予活血消癥益气方中药配方颗粒进行灌胃干预治疗。药用醋鳖甲1.5g（相当于饮片15g），醋莪术1.5g（饮片15g），醋三棱1.5g（饮片15g），西洋参4.5g（饮片15g），炙黄芪1g（饮片10g），醋白芍1.5g（饮片15g），炒白术1.67g（饮片10g），茯苓1g（饮片10g），生大黄0.5g（饮片5g），生甘草1.25g（饮片7.5g），人工麝香0.5g，配方颗粒融入120mL沸水中震荡摇匀为混悬液，冷却后按照1.23mL/100g体质量灌胃。

空白组、模型组给予等量生理盐水灌胃。每日干预1次，连续干预8周。

2.3 体质量检测及症状观察

将1L大烧杯置于电子天平上，去皮后取下，将大鼠置于大烧杯内，重新放置在天平上，待大鼠安定后读取测量值。每日观察记录1次大鼠的进食、毛发色泽、活动状态等基本情况。

2.4 标本采集及指标检测

肝脏HE及Masson染色：处死大鼠，取大鼠肝脏，置于4%的多聚甲醛中固定24h以上，然后制备成石蜡切片，采用HE染色及Masson染色对肝组织损伤情况及纤维化程度进行检测。肝功能指标检测：乌拉坦麻醉后切开腹部，自大鼠下腔静脉取血，以肝素抗凝，血样3000转低温离心30min，然后按照试剂盒说明书步骤对血样进行检测，所得检测结果换算为酶活力卡门氏单位。血清NO检测：大鼠下腔静脉血置于灭菌的EP管内，斜放于冰浴中，血液自然凝固后3000转低温离心5min，取血清用总NO检测试剂盒按照说明书步骤进行检测。血清ET-1、VEGF检测：大鼠下腔静脉血，以肝素抗凝，血样3000转低温离心30min，取血清用ET-1/VEGF ELISA试剂盒按照说明书步骤进行检测。TNF-α、IL-1β、IL-6检测：自大鼠下腔静脉取血，以肝素抗凝，取血样3000转低温离心15min后，按照TNF-α/IL-1β/IL-6 ELISA试剂盒说明书步骤对血样进行检测。

2.5 统计学处理

3 结 果

各组大鼠体质量结果比较见表1。模型组大鼠体质量显著高于空白对照组；模型组大鼠体质量升高到第4周开始逐渐下降，空白组、吡非尼酮组、鳖甲煎丸组、活血消癥益气方组体质量持续上升。

表1 连续给药8周各组大鼠体质量变化 （g，±s ）

表1 连续给药8周各组大鼠体质量变化 （g，±s ）

组别 只 第1w 第2w 第3w 第4w 第5w 第6w 第7w空白组 8 352.72± 6.05 367.30± 9.67 380.43±28.60 379.33±36.05 385.68±26.85 398.18±32.87 404.73±35.36模型组 8 458.93±16.89 489.03±34.95 513.30±39.83 518.94± 8.88 511.82±40.63 501.78±40.35 498.90±32.72吡非尼酮组 8 457.68±23.43 484.08±46.01 493.02±58.10 486.90±55.51 496.60±53.16 485.02±47.26 484.18±25.78鳖甲煎丸组 8 465.33±22.66 473.26±21.41 499.56±12.45 488.16±21.41 501.56±22.52 489.70±24.12 507.35±22.23活血消癥益气方组 8 440.17±15.09 460.97±43.19 453.78±36.29 445.43±29.78 451.63±35.28 443.85±37.86 456.03±38.41

各组大鼠肝组织病理切片结果比较见图1、图2。HE染色结果（图1）：空白对照组大鼠肝小叶结构正常，未见假小叶形成；肝细胞大小一致、核居中，围绕中央静脉呈条索状排列，未见肝细胞脂肪变性、坏死及其他明显病理变化；汇管区未见炎症细胞浸润及纤维组织增生。模型组大鼠肝组织内出现大片肝细胞坏死；大量宽厚纤维增生并分割正常的肝小叶，形成大小不等的肝细胞结节即假小叶；假小叶内肝细胞肝索结构模糊，肝细胞未见异型性，部分细胞出现脂肪变性；汇管区大量纤维组织增生并有大量淋巴细胞浸润，大量毛细胆管增生。吡非尼酮组无假小叶形成及肝细胞坏死。鳖甲煎丸组可见少量肝细胞坏死，纤细的纤维组织增生分割正常肝小叶并形成假小叶结构；汇管区较多的纤维组织增生及毛细胆管增生。活血消癥益气方组隐约纤细的纤维组织增生分割正常肝小叶并形成假小叶结构；汇管区少量纤维组织增生及毛细胆管。

图1 各组大鼠肝组织病理切片HE染色结 果

Masson染色结果（图2）：纤维组织成蓝色。空白对照组的纤维组织位于汇管区周边，未见分割肝小叶纤维组织。模型对照组汇管区周边可见大量的纤维组增生，宽厚纤维组织向周边肝组织延伸将肝细胞包绕成大小不等的团块状即假小叶形成，肝小叶内可见大片坏死的肝细胞。吡非尼酮组和鳖甲煎丸组可见染成蓝色的纤维组织增生，厚度中等并形成假小叶。活血消癥益气方组纤维组织位于汇管区周边，未见分割肝小叶纤维组织。

图2 各组大鼠肝组织病理切片Masson染色结果

各组大鼠血清AST、ALT、TP、ALB、TBil水平比较见表2。与空白对照组比较，模型对照组大鼠血清AST、ALT、TP、ALB、TBil差异有统计学意义（P＜0.01）。经过8周的干预治疗，吡非尼酮组、鳖甲煎丸组、活血消癥益气方组大鼠血清AST、ALT、TBil水平显著低于模型组（P＜0.01），ALB水平显著高于模型组（P＜0.01），TP水平与模型组比较差异无统计学意义（P≥0.05）；活血消癥益气方组大鼠血清AST、ALT水平显著低于吡非尼酮组、鳖甲煎丸组（P＜0.01），而ALB、TBil水平与吡非尼酮组、鳖甲煎丸组差异无统计学意义（P≥0.05）。

表2 各组大鼠AST、ALT、TP、ALB、TBil水平比较 （±s ）

表2 各组大鼠AST、ALT、TP、ALB、TBil水平比较 （±s ）

注：a）P、b）P、c）P、d）P分别表示与空白组、模型组、吡非尼酮组、鳖甲煎丸组比较差异有统计学意义，a）P、b）P、c）P、d）P均＜0.05。

组别 只 AST（U/L） ALT（U/L） TP（g/L） ALB（g/L） TBil（μM）空白组 8 29.24±2.46 20.86±3.50 79.06±3.81 40.50±2.24 6.55±0.44模型组 8 138.00±9.26a） 112.49±5.33a） 63.33±2.70a） 28.95±1.41a） 16.69±1.19a）吡非尼酮组 8 80.58±3.40ab） 62.73±2.59ab ） 65.49±2.91a） 35.21±1.42ab） 12.21±0.60a）鳖甲煎丸组 8 84.68±6.56ab） 57.95±2.24ab） 65.11±3.45a） 35.63± 2.40ab） 11.53±1.14ab）活血消癥益气方组 8 70.01±3.38abcd） 52.10±2.85abcd） 67.39±2.72a） 33.28±3.44ab） 11.20±1.04ab）

各组大鼠血清NO、ET-1、VEGF水平比较见表3。与空白组比较，模型组血清NO、ET-1、VEGF差异有统计学意义（P＜0.01）。经过8周的干预治疗，吡非尼酮组、鳖甲煎丸组、活血消癥益气方组大鼠血清NO、ET-1、VEGF均显著低于模型组（P＜0.05）；活血消癥益气方组大鼠血清NO显著低于吡非尼酮组（P＜0.05）；活血消癥益气方组大鼠血清ET-1、VEGF与鳖甲煎丸组、活血消癥益气方组比较差异无统计学意义（P≥0.05）。

表3 各组大鼠血清NO、ET-1、VEGF水平比较 （±s ）

表3 各组大鼠血清NO、ET-1、VEGF水平比较 （±s ）

注：a）P、b）P、c）P、d）P分别表示与空白组、模型组、吡非尼酮组、鳖甲煎丸组比较差异有统计学意义，a）P、b）P、c）P、d）P均＜0.05。

组别 只 NO（μM） ET-1（pg/mL）VEGF（pg/mL）空白组 8 74.35±3.98 25.34±1.58 27.99±1.00模型组 8 277.19±24.21a） 46.96±2.21a） 79.13±4.78a）吡非尼酮组 8 189.74±24.62ab）40.33±1.98ab） 59.36±2.98ab）鳖甲煎丸组 8 167.94±11.17ab）40.20±3.52ab） 61.21±2.59ab）活血消癥益气方组 8 160.34±8.69abc） 37.29±1.22ab）58.05±3.71ab）

各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6结果比较见表4。与空白组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6差异有统计学意义（P＜0.01）。经过8W的干预治疗，吡非尼酮组、鳖甲煎丸、活血消癥益气方组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6均显著低于模型组（P＜0.01）；活血消癥益气方组大鼠血清TNF-α、IL-1β显著低于鳖甲煎丸组（P＜0.01），但显著高于吡非尼酮组（P＜0.01）；活血消癥益气方组大鼠血清IL-6与鳖甲煎丸组比较，差异无统计学意义（P≥0.05），与吡非尼酮组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表4 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6结果比较 （±s ）

表4 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6结果比较 （±s ）

注：a）P、b）P、c）P、d）P分别表示与空白组、模型组、吡非尼酮组、鳖甲煎丸组比较差异有统计学意义，a）P、b）P、c）P、d）P均＜0.05。

IL-6（pg/mL）空白组 8 47.32±3.27 14.24±1.00 27.18±2.34模型组 8 217.82±11.74a） 55.90±3.93a） 99.56±9.44a）吡非尼酮组 8 102.61±5.24ab） 23.86±2.16ab） 60.79±6.83ab）鳖甲煎丸组 8 179.11±7.71abc） 38.35±2.90abc） 78.69±4.66abc）活血消癥益气方组 8 136.27±6.51abcd）32.46±2.44abcd）70.51±5.19abc）组别 只 TNF-α（pg/mL）IL-1β（pg/mL）

4 讨 论

肝硬化是一种损伤后的修复反应，在这一过程中肝脏星状细胞活化是中心环节，还包括正常肝细胞外基质的降解，纤维瘢痕组织聚集和血管扭曲变形以及细胞因子释放等［3］。本病属中医“鼓胀”“积聚”“胁痛”等范畴，被古代医家列为“风、痨、鼓、膈”四大顽证之一，为临床重症，治疗较为困难［6］。《黄帝内经》即有鼓胀的记载，如《灵枢·水胀》记载其症状有“腹胀，身皆大，大与肤胀等也，色苍黄，腹筋起”。现代医家大多认为肝硬化由肝、脾、肾三脏功能失调，气滞、血瘀、水停瘀结腹中所致［7］，主要治疗原则为活血化瘀、扶正补虚、清热解毒、健脾利湿等［3］。

李力强认为，肝硬化属本虚标实、虚实夹杂之证，因正气不足，肝气郁结、气机不畅，气滞血瘀、湿浊内蕴，肝、脾、肾功能失调，三焦气化不利，水湿不化，凝聚成痰，导致痰瘀阻络、聚水为胀而发病，治宜活血消癥、健脾益气、疏肝理气，并以《太平圣惠方》鳖甲丸为基础研制了活血消癥益气的中药复方鳖甲消癥丸治疗。复方由醋鳖甲、醋三棱、醋莪术、人工麝香、西洋参、炙黄芪、醋白芍、炒白术、茯苓、生大黄、生甘草等组成。醋鳖甲入肝消积、软坚散结，麝香通窍活络、活血消癥，为君药；醋莪术与醋三棱活血行气、消癥止痛，为臣药；西洋参和炙黄芪补益气血、扶益正气，醋白芍柔肝止痛，炒白术和茯苓健脾益气、利水祛湿，共为佐药；生大黄活血化瘀、荡涤湿热，生甘草缓急止痛、调和诸药，共为使药。诸药合用，共奏益气活血、化瘀消癥之功，标本同治。临床应用表明，鳖甲消癥丸对预防肝硬化门静脉高压食管胃底静脉破裂出血、抗肝纤维化等有显著效果［4，8-9］，能明显改善肝区疼痛、黄疸、腹水、蜘珠痣、肝掌、舌边瘀斑、脾肿大等症状；显著降低门静脉压力和食管静脉压力，改善食管静脉曲张，预防食管胃静脉出血；改善肝纤维化，降低肝内血管和门体侧支血管阻力。

研究发现，模型组大鼠体质量升高到第4周开始逐渐下降，血清AST、ALT、TP、ALB、TBil、NO、ET-1、VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6与空白组比较差异有统计学意义。模型组大鼠肝组织内出现大片肝细胞坏死，大量纤维增生，假小叶形成，假小叶内肝细胞肝索结构模糊，肝细胞未见异型性。汇管区大量纤维组织增生并有大量淋巴细胞浸润，大量毛细胆管增生。吡非尼酮是一种新型口服吡啶酮类化合物，临床研究表明吡非尼酮具有广谱抗肺、心、肝、肾纤维化及抗炎、抗氧化作用，能够抑制转化生长因子（TGF）-β、TNF-α等多种促纤维化和促炎细胞因子［10］。近年来实验证实［11-13］，吡非尼酮能有效改善肝纤维化大鼠肝脏炎症、纤维化，可显著降低受损肝脏组织及血清中TNF-α、IL-1、IL-6等的产生，减轻中性粒细胞等炎症细胞在肝内浸润造成的肝损伤，显著降低血清AST、ALT、TBil含量，认为吡非尼酮可能是通过抑制炎症反应阻断肝纤维化于早期阶段。鳖甲煎丸原方出自张仲景的《金匮要略》，由炙鳖甲、阿胶、蜂房等23味中药组成，具有活血化瘀、软坚散结之功，为治疟母、癥瘕等病的主方。临床大量研究证实，鳖甲煎丸治疗肝硬化疗效显著［14-16］。唐承璐等发现［17］，鳖甲煎丸能明显降低肝硬化患者血清AST、ALT、TBil、TNF-α、IL-1β，升高血清ALB，认为鳖甲煎丸能减轻肝硬化患者的肝脏炎症和纤维化。本研究的结果与此一致，表明吡非尼酮、鳖甲煎丸均能显著改善肝硬化模型大鼠的肝功能、肝脏炎症及纤维化。NO是具有扩张血管的活性物质，肝细胞严重受损时导致NO合成增加，过量的NO会抑制干细胞合成白蛋白，形成低蛋白血症，加重腹水；ET-1主要由血管内皮细胞产生，肝硬化时肝细胞和肝内血管增生，使ET-1的分泌增加，引起肝血窦收缩导致肝内循环受阻，肝细胞缺血缺氧，加重水肿和肝纤维化［18-19］；VEGF及其相关信号转导通路在肝脏炎症、纤维化发生发展过程中发挥着重要作用，包括促进血管生成、肝星状细胞（HSC）活化与迁移以及促进炎症、纤维化因子释放［20］。本研究结果表明，吡非尼酮组、鳖甲煎丸能显著降低肝硬化模型大鼠血清NO、ET-1、VEGF水平，进一步证实了这两个药物可有效治疗肝硬化。

研究中，经过8周的干预治疗，活血消癥益气方组大鼠肝组织纤维化程度明显减轻，结缔组织增生显著减少，肝细胞炎性浸润程度明显减轻；血清AST、ALT水平显著低于吡非尼酮组、鳖甲煎丸组，而ALB、TBil水平与吡非尼酮组、鳖甲煎丸组无差异，表明活血消癥益气方能更加有效的改善肝硬化模型大鼠肝功能的损伤。活血消癥益气方组大鼠血清NO水平显著低于吡非尼酮组，与鳖甲煎丸组比较差异无统计学意义，而ET-1、VEGF水平与吡非尼酮、鳖甲煎丸组比较，差异无统计学意义，表明活血消癥益气方对肝硬化大鼠血管内皮功能相关因子的影响与吡非尼酮、鳖甲煎丸无明显差异。活血消癥益气方组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平显著低于鳖甲煎丸组，两组的IL-6水平比较差异无统计学意义；而活血消癥益气方组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著高于吡非尼酮组，表明活血消癥益气方对肝硬化大鼠炎性因子的影响优于鳖甲煎丸，但比吡非尼酮的效果略差。因此，活血消癥益气方能够有效改善肝硬化模型大鼠肝功能、抗大鼠肝纤维化和炎症反应，作用机制可能与调控血清NO、ET-1、VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6等血管内皮功能及炎性因子相关。

综上所述，经过干预治疗，吡非尼酮组、鳖甲煎丸、活血消癥益气方组大鼠血清AST、ALT、TBil、NO、ET-1、VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著低于模型组，病理切片结果提示肝纤维化、肝细胞损害明显好转，表明3种药物对肝硬化大鼠肝功能损伤、肝纤维化和炎性反应均能有效抑制或一定程度逆转。活血消癥益气方对肝硬化模型大鼠肝功能损害的改善、炎性因子影响优于鳖甲煎丸，改善肝功能损害方面与吡非尼酮无显著差异，而对炎性因子的影响效果相对较差。