黄芩苷抑制核因子κB信号通路对糖尿病鼠心肌保护机制研究*

徐秋玲，郑学芝，郭 冉，王文婷，张绪东

(牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011)

心肌纤维化是糖尿病心肌损伤的病理机制之一，高糖刺激导致炎性反应在糖尿病心肌损害中发挥着重要作用[1]。细胞Toll样受体(TLR)是Ⅰ型跨膜蛋白，活化后激活下游核因子κB(NF-κB)，使细胞内炎性细胞因子增多，导致心肌间质胶原纤维大量沉积，心肌间质纤维化[2]。中药黄芩的主要活性成分为黄芩苷，可抑制高血压大鼠心肌细胞纤维化[3]。但黄芩苷对糖尿病心肌纤维化是否具有作用，且相关研究较少。本研究通过建立大鼠糖尿病模型，观察了黄芩苷与TLR/NF-κB 信号通路的关系，旨在探讨黄芩苷干预糖尿病心肌纤维化机制。

1 材料与方法

1.1材料 雄性SD大鼠由哈尔滨医科大学实验动物学部提供，黄芩苷购自Sigma公司(高效液相色谱测定含量大于95%，用生理盐水配制药液)，masson染色试剂购自福州迈新生物技术公司，兔抗鼠白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、TLR4、核因子-κBp65(p65)、Ⅰ型胶原(collagenⅠ)多克隆抗体均购自Abcam公司，兔抗鼠β-actin多克隆抗体购自博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1建立糖尿病大鼠模型 2019年7月选取雄性SD大鼠25只，体重180～222 g，尾静脉注射链脲佐菌素45 mg/kg(溶于0.1 mmol/L枸橼酸缓冲液)。72 h后连续2次空腹血糖大于或等于16.7 mmol/L为糖尿病模型造模成功，共20只。

1.2.2分组与给药 将40只大鼠按照随机区组设计法分为对照组(NC组，腹腔注射生理盐水)、糖尿病模型组(DM组，腹腔注射生理盐水)、黄芩苷+糖尿病组[Baicalin+DM组，腹腔注射黄芩苷药液15 μmol/L/(kg·d)]和黄芩苷+对照组[Baicalin+NC组，腹腔注射黄芩苷药液15 μmol/L/(kg·d)]，每组10只。连续用药8周。

1.2.3Masson染色 取各组大鼠心尖组织制备石蜡切片，按masson染色试剂盒说明书进行操作。每组取材6张片子，高倍镜(400×)下观察。计算心肌胶原容积分数[CVF=(胶原面积/全视野面积)×100%]。

1.2.4Western-blotting检测IL-1β、TNF-α、TLR4、p65、collagenⅠ蛋白水平 按试剂说明书提取各组大鼠心肌组织总蛋白，检测蛋白浓度和纯度，进行分装，每管蛋白为50 μg，冻存于-80 ℃冰箱备用。Western-blotting步骤：十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺电泳，转膜，免疫反应(封闭液稀释一抗1∶100、二抗1∶1 000)，二氨基联苯胺显色。采用4000R柯达成像系统凝胶成像仪采集图像并进行分析。计算条带光密度值与条带面积比值。

1.2.5观察指标 观察各组大鼠血糖、心脏重量指数(心脏重量/体重)、CVF，以及IL-1β、TNF-α、TLR4、p65、collagenⅠ蛋白水平等。

2 结 果

2.1各组大鼠血糖、心脏重量指数比较 与NC组比较，DM组大鼠血糖明显升高，心脏重量指数明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05)；与DM组比较，Baicalin+DM组大鼠血糖明显降低，心脏重量指数明显减小，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。

A：各组血糖比较；B：各组心脏重量指数比较;与NC组比较，aP<0.05；与DM组比较，bP<0.05。

表1 各组大鼠血糖、心脏重量指数比较

2.2各组大鼠心肌组织变化及CVF比较 DM组大鼠心肌纤维排列紊乱，部分肌纤维被蓝染的胶原纤维取代，纤维组织明显增生；与DM组比较，Baicalin+DM组大鼠心肌纤维排列较规则，肌纤维变性较轻，纤维组织增生明显减少。与NC组比较，DM组大鼠CVF明显升高，与DM组比较，Baicalin+DM组大鼠CVF明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2、3。

A：NC组；B：DM组；C：Baicalin+DM组；D：Baicalin+NC组。

2.3各组大鼠心肌IL-1β、TNF-α、TLR4、p65、collagenⅠ表达水平比较 与NC组比较，DM组大鼠心肌IL-1β、TNF-α、TLR4、p65、collagenⅠ表达水平均明显升高，与DM组比较，Baicalin+DM组大鼠心肌IL-1β、TNF-α、TLR4、p65、collagenⅠ表达水平均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2，图4、5。

与NC组比较，aP<0.05；与DM组比较，bP<0.05。

表2 各组大鼠心肌NF-κB p65/β-actin表达水平比较

A：NC组；B：DM组；C：Baicalin+DM组；D：Baicalin+NC组。

A为IL-1β，B为TNF-α，C为TLR4,D为p65,E为collagenⅠ；与NC组比较，aP<0.05；与DM组比较，bP<0.05。

3 讨 论

心肌间质纤维化，即胶原纤维大量沉积是高血糖侵害下导致心肌损害的重要病变之一，纤维化增加了心室壁僵硬度，降低了心室顺应性，导致心功能不全[4]。临床研究发现，终末期心力衰竭患者死亡的主要原因为心肌间质纤维化[5]。本研究结果显示，与对照组比较，DM组大鼠心脏重量指数明显增加，心肌纤维排列紊乱，纤维组织增生明显，胶原纤维增多。心肌collagenⅠ表达水平明显增加，印证了在高血糖因素刺激下可导致心肌纤维化，影响心脏功能。

有研究表明，敲除免疫球蛋白样受体b4的大鼠出现病理性心肌肥大，心肌炎性反应增强，心肌纤维化，而NF-κB信号通路参与了这一病理机制[6]。在新生大鼠心脏成纤维细胞的研究发现，NF-κB参与了血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化，使用 NF-κB抑制蛋白α(IκBα)抑制NF-κB活性可减轻纤维化进程[7]。本研究DM组大鼠心肌NF-κB p65蛋白和炎性性别因子--IL-1β、TNF-α表达水平均明显升高，collagenⅠ表达水平也明显升高，推测高浓度葡萄糖激活了NF-κB信号通路，诱导了异常的炎性反应，心肌细胞过表达炎性性别因子，TNF-α、IL-1β释放增多，侵害心肌组织。

TLR主要分布在淋巴细胞、巨噬细胞、血管细胞表面，TLR有多种亚型，其中TLR4在心脏组织中表达水平最高，在心肌缺血再灌注损伤中TLR4参与了IL-10基因敲除小鼠心肌纤维化病理机制[8]。TLR4与配体结合后先活化IκB激酶，导致细胞内NF-κB/IκB复合物IκB亚基被丝氨酸磷酸化，蛋白酶降解，从而释放NF-κB二聚体，NF-κB进入细胞核，结合在NF-κB结合位点，启动转录进程。激活细胞核内NF-κB，在心肌梗死损伤介导的炎性反应中发挥着重要作用[9]。炎性性别因子主要通过Toll样受体识别损伤的相关分子模式，导致炎性反应。TLR4诱发心肌细胞免疫反应，释放炎性性别因子，致使细胞外基质沉积，促进心肌纤维化病程发展[10]。有研究发现，糖尿病动脉粥样硬化病变时机体血管内皮细胞TLR4蛋白表达上调，NF-κB被激活，加剧了动脉粥样硬化斑块的形成，推测TLR4/NF-κB信号通路参与了血管的炎性反应，介导糖尿病动脉粥样硬化病理过程[11-12]。本研究结果显示，高血糖刺激同样可诱导NF-κB活化，加重心肌炎性反应，同时本研究Western-blotting检测结果显示，DM组大鼠心肌TLR4表达水平明显高于NC组，表明高血糖是通过TLR/NF-κB信号通路导致心肌炎性反应增强。

黄芩苷(C21H18O11)是黄芩中主要的黄酮类成分，具有多种药理作用，如抑菌抗炎、调节免疫、抗氧化、抗纤维化、心血管保护作用等。在血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞中黄芩苷调节了腺苷酸激活蛋白激酶/转化生长因子-β/sma和mad的同源蛋白信号通路，抑制细胞增殖及胶原合成，降低纤维连接蛋白和结缔组织生长因子表达，可抑制心肌纤维化，预防心力衰竭[13]。在慢性压力超负荷小鼠模型中黄芩苷能减轻因压力超负荷引起的心功能障碍和心室重构[14]。在肾性高血压大鼠心肌中黄芩苷可减少心肌细胞凋亡，减轻内质网应激反应，抑制心肌纤维化，改善心室重构[15]。黄芩苷在高血糖诱导心肌纤维化中的作用和分子机制的研究较少，本研究探讨了黄芩苷对糖尿病心肌纤维化的机制，结果显示，Baicalin+DM组大鼠血糖明显低于DM组，表明黄芩苷具有降低血糖的作用，且黄芩苷能改善糖尿病大鼠心肌纤维化，Baicalin+DM组大鼠心肌IL-1β、TNF-α、TLR4、p65表达水平均明显低于DM组，推测黄芩苷通过抑制TLR4/NF-κB信号通路、减少NF-κB的核转位、抑制炎性性别因子释放而改善心肌纤维化，起到保护心肌的作用，但黄芩苷调控TLR4的机制尚需进一步研究。