南板蓝根不同提取物中靛蓝、靛玉红和色胺酮含量及其抑菌活性的研究※

●孙 媛 田秀秀 丁江生

南板蓝根来源于爵床科植物马蓝[Baphicacanthuscusia(Nees)Bremek.]的干燥根茎和根，味苦，性寒，具有清热解毒、凉血消斑等功效，可用于瘟疫时毒、发热咽痛、温毒发斑等，已被广泛应用于各种制剂中。现代研究证明，南板蓝根含有多种化学成分，如（R,S）-告衣春、腺苷、靛蓝、靛玉红、多糖、色胺酮等；具有良好的抗病毒、抗菌、抗肿瘤、抗炎等方面的药理活性，包括灭活甲型流感病毒，延长流感病毒FM1株感染小鼠的平均存活天数，抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和皮肤真菌，治疗慢性粒细胞性白血病，抑制一般癌肿细胞生长和扩散程度等。其中抗病毒、抗肿瘤等方面研究报道较多，但抗菌方面的许多作用机理仍待考察。本中心根据前期研究结果，拟将其组方开发为治疗痤疮的外用产品。

然而，南板蓝根作为常用中药，虽大众接受度高，但在不同产地、野生和栽培品种、不同溶剂提取物之间质量差异明显。同时，《中国药典》南板蓝根项下，未见对其质量指标成分的定量控制。为进一步研究南板蓝根成分与抑菌活性的相关性，采用高效液相色谱法，以南板蓝根主要成分靛蓝、靛玉红和色胺酮为指标，对南板蓝根水、醇等不同溶剂提取物的指标成分含量情况和对丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的体外抑菌情况进行考察，为该药规范质量，优化提取溶剂，拓宽使用范围，开发外用抑菌产品研究提供依据[1-10]。

1 材料

1.1 仪器Agilent1100 高效液相色谱仪（美国安捷伦）；KQ5200DE 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BSA224S-CW 电子天平[赛多利斯科学仪器（化学）有限公司]；JJ-2000型电子天平（江苏常熟市双杰测试仪器厂）；BCD-208K/A 海尔冰箱（青岛海尔股份有限公司）；DZTW调温电热套（北京市永光明医疗仪器有限公司）；DZKW-S-6电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗）；BPZ-6210LC 型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；THZ-D型台式恒温振荡器（江苏太仓实验设备厂）；Thermo Multiskan GO 全波长酶标仪（美国BIO-RAD公司）；GNP-9270隔水式恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.2 试药靛蓝对照品（北京世纪奥科，批号170404，编号482-89-3，HPLC≥98%）；靛玉红对照品（中国食品药品检定研究院，批号110717-200204）；色胺酮对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号M10O8L45439，编号S31557，HPLC≥98%）；南板蓝根（昆明市官渡区千草源中药材经营部，批号20170527）；美罗培南[佳友制药（苏州）有限公司，批号20161204]；乙腈（色谱纯，默克股份）；水为高纯水；N,N-二甲基甲酰胺、95%乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷均为分析醇；酵母提取物（Oxoid Ltd,Basingstoke,Hampshire,England，批号LP0021）；胰蛋白胨（Oxoid Ltd,Basingstoke,Hampshire,England，批号LP0042）；氯化钠（上海试四赫维化工有限公司，批号 1306101）；MUELLER-HINTON（Oxoid Ltd,Basingstoke,Hampshire,England，批号CM0405）；沙氏葡萄糖液体培养基(青岛高科园海博生物技术有限公司，产品批号HB0253-7)；琼脂粉（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号20091102）。

1.3 供试菌种丙酸杆菌Propionibacterium acnesATCC11827；金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC29213；白色念珠菌Canidia albicans ATCC10231 均购自美国特种物品贮藏中心（ATCC），接种、传代后于4 ℃保存。

2 方法与结果

2.1 南板蓝根不同溶剂提取物的制备称取相同重量的南板蓝根药材，分别加入10倍量的水、甲醇、50%乙醇、80%乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮溶剂，分别加热回流提取2次，每次2 h，过滤提取液，60 ℃真空浓缩，干燥，即得南板蓝根不同溶剂提取物。密封阴凉保存，备用。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 ECOSIL 120-5-C18 色谱柱(5.0 μm，4.6×250 mm，广州绿百草)，乙腈∶水=70∶30 为流动相，柱温25 ℃，流速1.0 mL·min-1，进样量10 μL，检测波长289 nm。

2.2.2 对照品溶液制备 分别精密称取靛蓝、靛玉红和色胺酮对照品2.060 mg、2.520 mg、10.112 mg，置50 mL 容量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺溶解并定容至刻度，超声（150 W，40 kHz）5 min，摇匀，即得。

2.2.3 样品溶液制备 分别精密称取2.1项下的南板蓝根不同溶剂提取物0.5 g，置于50 mL容量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺40 mL，超声20 min，放冷，N,N-二甲基甲酰胺定容至刻度，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.4 专属性试验 取2.2.2 项下的对照品溶液，取N,N-二甲基甲酰胺为空白溶液，按2.2.3 项下的制备方法，取南板蓝根80%乙醇提取物，制备样品溶液；并分别加入靛蓝、靛玉红和色胺酮对照品，制备对照及样品混合溶液。按上述色谱条件进行测定，记录色谱图。此条件下靛蓝、靛玉红和色胺酮分离良好，无干扰。见图1。

图1 专属性实验HPLC图

2.2.5 线性关系考察 分别精密量取2.2.2 项下靛蓝、靛玉红和色胺酮混合对照品溶液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺定容，摇匀，分别得到靛蓝浓度为：4.12，8.24，16.48，24.72，32.96，41.20 μg.mL-1；靛玉红浓度为：5.04，10.08，20.16，30.24，40.32，50.40 μg.mL-1；色胺酮浓度为：20.22，40.45，80.90，121.34，161.79，202.24 μg.mL-1的对照品溶液，0.45 μm 滤膜过滤，按2.2.1 项下色谱条件测定，记录峰面积。以对照溶液浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线,结果见表1。

表1 靛蓝、靛玉红和色胺酮线性关系（n=6）

2.2.6 精密度试验 精密量取2.2.5 项下混合对照品溶液，按上述色谱条件，连续进样6 次，记录峰面积，并计算RSD值。结果表明，靛蓝、靛玉红和色胺酮的日内精密度RSD 值分别为1.41%（n=6）、0.77%（n=6）、1.62%（n=6），表明日内精密度良好。连续进样3天，记录峰面积，并计算RSD 值。结果表明，靛蓝、靛玉红和色胺酮的日间精密度RSD值分别为1.46%（n=6）、0.81%（n=6）、0.71%（n=6），表明日间精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 取同一份样品溶液，分别于0，2，4，6，10，12 h按上述色谱条件测定，记录峰面积，并计算RSD 值。结果表明，靛蓝、靛玉红和色胺酮的稳定性RSD 值分别为2.90%（n=6）、2.24%（n=6）、1.39%（n=6），表明样品溶液在12 h内稳定。

2.2.8 重复性试验 精密称取0.5 g 南板蓝根80%乙醇提取物6份，按2.2.3项下要求，配制样品溶液，按上述色谱条件测定，记录峰面积，并计算RSD 值。结果表明，靛蓝、靛玉红和色胺酮的重复性RSD 值分别为2.36%（n=6）、1.29%（n=6）、1.39%（n=6），表明重复性良好。

2.2.9 回收率试验 精密称取已知含量的南板蓝根提取物，分别按含量的50%，100%，150%精密加入靛蓝、靛玉红和色胺酮对照品，按2.2.3 项制备样品溶液，每个浓度平行制备3份，按上述色谱条件测定，记录峰面积，计算回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n=9）

2.2.10 得率测定 分别精密称取0.5g 南板蓝根不同溶剂提取物，按2.2.3项制备样品溶液，并根据线性范围适当稀释，每个样品平行制备2 份，按上述色谱条件测定，记录峰面积，计算含量，并结合提取率，计算各提取物在生药材中对应靛蓝、靛玉红和色胺酮的得率。结果提示，南板蓝根乙酸乙酯提取物中靛蓝和靛玉红对应的生药材得率最高，分别为0.6702 mg/g和0.2353 mg/g；80%乙醇提取物中色胺酮对应的生药材得率最高，为0.1017 mg/g。见表3。

表3 南板蓝根不同溶剂提取物得率测定结果

2.3 体外抑菌活性测定

2.3.1 菌种培养 从菌落平板上挑选丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌分别接种于已灭菌的MH、LB、沙氏液体培养基中，37 ℃，100 rpm/min振荡培养24 h。活化后，按1∶100 接种，以37 ℃、200 rpm/min振荡培养12 h。其中丙酸杆菌、白色念珠菌全程厌氧。

2.3.2 最小抑菌浓度（MIC）测定 96孔细胞培养板经紫外线照射30 min后，采用连续二倍微孔稀释法，以美罗培罗为阳性对照，同时设立受试样品（其中极性偏大的提取物，如水、甲醇、50%乙醇、80%乙醇提取物样品浓度为15.00 mg/mL；极性偏小的提取物，如乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮提取物样品浓度为6.20 mg/mL）、菌液对照、培养基对照和溶媒对照。调整菌浓度至含1×106CFU/mL 活菌，每排第一孔内加入190 μL 菌液，第二至第十二孔内均加入100 μL 菌液。分别将受试样品10 μL加入第一孔中，混匀后吸取100 μL 菌液加入第二孔中，继续混匀后再吸取100 μL菌液加入第三孔。依次操作，最后，第十二孔内溶液混匀后吸取100 μL 弃去。37 ℃，培养24 h，其中丙酸杆菌、白色念珠菌全程厌氧培养。未见混浊的最低样品浓度即为最小抑菌浓度。结果表明，南板蓝根乙酸乙酯提取物对丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌有明显抑制作用，MIC分别为0.155 mg/mL和0.310 mg/mL；80%乙醇提取物对白色念珠菌有抑制作用，MIC为0.750 mg/mL。见表4。

表4 南板蓝根不同溶剂提取物抑菌作用结果

3 讨论

南板蓝根作为历史悠久的中药，分布及使用范围广，化学成分复杂。我中心拟将南板蓝根与重楼等不同抑菌机理的中药组合，开发用于痤疮治疗的外用制剂。因此，本研究选用丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌为菌种进行评价，并优先探索南板蓝根成分报道较集中的靛蓝、靛玉红和色胺酮在不同溶剂提取物中的生药材得率及活性情况。本研究结果表明，南板蓝根以乙酸乙酯为提取溶剂效果更佳。

实验结果表明，南板蓝根乙酸乙酯提取物对丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌均有明显抑制作用，其中对丙酸杆菌作用略强。同时发现，南板蓝根乙酸乙酯提取物中靛蓝、靛玉红对应的生药材得率也高于其它提取物，分别为0.6702 mg/g 和0.2353 mg/g。此外，南板蓝根80%乙醇提取物对白色念珠菌有抑制作用，其余提取物均未出现，对比得率，发现其色胺酮对应的生药材得率最高，为0.1017 mg/g。因此，推测南板蓝根的抑菌活性与靛蓝、靛玉红和色胺酮有一定相关性。

研究发现，不同来源的南板蓝根采用同一溶剂提取，提取率和指标成分含量差异明显。因此，评价南板蓝根不同溶剂提取物中靛蓝、靛玉红和色胺酮的含量，以最终可从生药材中获得的得率为指标，更具实用和指导意义。