基于网络药理学探讨二至丸治疗糖尿病脱发的作用机制※

●陈朝阳 冉俊宁 文启友 姚 婷 杨佳丽 邓奕辉

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一组以血糖增高伴脂肪、蛋白质代谢紊乱的慢性内分泌代谢性病群，可导致多器官系统受累并伴有大、小血管及非血管的并发症[1]。糖尿病及其并发症（如糖尿病心血管病变、视网膜病变、肾病等）的存在导致患者生活质量下降，全球死亡率增加，已成为全球最大的公共卫生问题、十大死亡原因之一[2-6]。据国际糖尿病联合会（IDF）评估，若不采取有效的控制方法，至2045年受害患者将增加到6.93亿成年人[7]。

脱发不仅影响美观更损害心理健康，研究发现脱发增加了患者焦虑和抑郁的概率[8]。因此，糖尿病合并脱发严重危害患者身体、心理健康，必须引起重视。关于糖尿病脱发的病因，相关研究认为：（1）血糖、血脂、血压升高是导致脱发的危险因素，同时亦可促进胰岛素抵抗（IR），而IR 是造成上述因素的基本环节和病理基础，有研究表明IR 与女性早发型脱发存在明显相关性，而血糖升高在男性脱发中尤为突出[9]；（2）DM 人群毛发的生长速度较正常人减慢[10]；（3）部分降糖药如利拉鲁肽等可通过减少食欲、降低营养吸收或免疫相关反应等直接或间接性导致脱发[11]。

对于脱发的中医病因病机，赵晖[12]认为可从虚实两方面探讨，其一为虚，“发为血之余”，肾藏精，肝藏血，肝肾同源，精血互生，肝肾亏虚则发失所养；其二为实，嗜食肥甘厚味使脾失运化，水液运行受阻而停滞，郁而化热，湿热上蒸毛发使毛孔油腻堵塞可致脱发，气行则血行，气滞则血停，平素情志抑郁，气血运行受阻，气滞血瘀使血无法濡养发根，或血热之人外感风热，耗伤阴血则发根失去濡养。徐灿坤[13]也发现程益春教授多将脱发归因于血虚和湿热，治应活血凉血养血及祛湿除热和疏散风邪为主。而崔伟霞[14]亦发现大多数学者认为脱发的病因病机主要有以下3个方面：湿热、血虚风燥及肝肾亏虚。

二至丸由滋补肝肾的女贞子、墨旱莲组成，后者兼凉血止血之功，二者性平和、偏寒，等量(1∶1)配伍，既滋阴补血，又不滋腻碍脾、阻滞气机，具有补肾养肝、乌须发之功，为经典的平补肝肾之方[15-17]。近几年研究结果发现，二至丸除具有降糖活性外，还具备改善血液流变性、调节免疫机能等功效，在治疗糖尿病及其并发症和相关代谢综合征方面具有良好的疗效[18-22]。本研究通过网络药理学多靶点、多通路的研究，进一步探讨二至丸治疗糖尿病脱发的作用机制，为临床治疗糖尿病脱发提供用药依据。

1 材料与方法

1.1 材料TCMSP中药系统药理学数据库与分析平台（https://tcmspw.com/tcmsp.php），Pubchem分子库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，Chemspider 化学结构与文献数据库（http://www.chemspider.com/），Swiss TargetPrediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/），Genecards、TTD、OMIM 数据库，Draw Venn Diagram 数据库（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），String数据库（https://string-db.org/），DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/），imageGP (http://www.Ehbio.com)，Cytoscape3.7.1软件，Uniprot数据库[23-25]。

1.2 方法

1.2.1 二至丸活性成分筛选及相关靶点预测 将二至丸的墨旱莲、女贞子两味药物在TCMSP 平台上分别检索并收集活性成分，筛选条件为：口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18[26]。将筛选后的具有较高活性的药物输入PubChem 及ChemSpider 数据库进行检索、获取相应的化学结构式，不能获取相应化学结构式的药物予以剔除。将筛选后的化合物在Swiss Target Prediction 数据库进行靶点预测，物种设置为“Homo sapiens”，剔除无靶点者，并通过Uniprot数据库使靶点名称规范化。

1.2.2 糖尿病脱发靶点预测 采用Genecards、TTD、OMIM数据库，以“Diabetic hair loss”为检索词，收集并筛选糖尿病脱发的作用靶点，Genecards 数据库筛选条件为：Score＞30[25]。

1.2.3 疾病与二至丸共同靶点的收集 通过Draw Venn Diagram 平台，将墨旱莲、女贞子与糖尿病脱发的靶点输入，分别以MHL、NZZ、Diabetic hair loss 代表，构建韦恩图，得到疾病与二至丸共同靶点。

1.2.4 构建共同靶点蛋白互作网络 将共同靶点导入String数据库，选定Multiple protein，物种选择Homo sapiens，最低互动分数为默认值（0.400），得到蛋白互作网络PPI 信息，将从PPI 获得的信息node1、node2、combined-score值导出至Excel2016，通过Cyto⁃scape3.7.1进行可视化，利用Network analyzer 进行PPI的拓扑分析，得到Degree值[23]。

1.2.5 共同靶点GO 生物注释和KEGG 通路富集分析 利用DAVID 数据库将共同靶点进行GO 生物注释和KEGG 通路富集分析。设定靶点为“OFFICIALGENE-SYMBOL”格式，Background 选择“Homo sapi⁃ens”，筛选标准为：P＜0.05，Count=2[23]。分别导出基因功能的三个部分细胞组分CC、分子功能MF、生物过程BP，进行GO 分析。取P值的负对数，-lgP越大，说明富集程度越高，根据-lgP值取CC、MF、BP前10位的相关信息在imageGP 平台构建气泡图[23]。同时，将排名前20通路的Term、Genes、-lgP值导入至Cyto⁃scape3.7.1进行可视化，构建靶点-通路网络图。

2 结果

2.1 二至丸活性成分信息及药物相关靶点汇总利用TCMSP共收集到二至丸的活性成分167个，其中墨旱莲48 个，女贞子119 个，筛选后的候选化合物有23个，其中墨旱莲10个，女贞子13个，其中墨旱莲、女贞子共同活性成分2 个（luteolin/木犀草素、quercetin/槲皮素），见表1。剔除无化学结构、靶点的化合物：墨旱莲（MOL003378），女贞子（MOL005169、MOL005195、MOL005212、MOL005147、MOL004576）。得到二至丸相关靶点764个，其中墨旱莲326个，女贞子438个。

表1 二至丸候选化合物基本信息

2.2 疾病相关靶点信息利用Genecards、TTD、OMIM 数据库收集并筛选得到糖尿病脱发相关靶点291个。

2.3 共同靶点信息将糖尿病脱发相关靶点291 个与二至丸相关靶点764 个通过Draw Venn Diagram 平台取交集并绘制韦恩图，得到共同靶点48个，韦恩图见图1，具体共同靶点见表2。

表2 二至丸活性成分化合物与糖尿病脱发共同靶点

图1 二至丸活性成分化合物与糖尿病脱发靶点韦恩图

2.4 共同靶点PPI分析及核心靶点筛选共同靶点的Degree值见表3，其中根据Degree值设定节点大小，Degree 值越大，节点越大；根据Combine score 值设定边线粗细，值越大，边线越粗；设定1≤Degree≤10 为绿色，10＜Degree≤20 为蓝色，20＜Degree≤30 为紫色，30＜Degree≤40为红色。利用Cytoscape3.7.1构建共同靶点蛋白PPI网络图，该图共有48个靶点，包含48个节点，394条边，见图2。由图及表可知，二至丸治疗糖尿病脱发的重要靶标分别为：AKT 丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT1）、非受体酪氨酸激酶C（SRC）、V-Ha-Ras 肉瘤病毒癌基因同源物（HRAS）、表皮生长因子受体（EGFR）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、肿瘤坏死因子（TNF）、磷脂酰肌醇3 激酶（PIK3CA）、纤连蛋白1（FN1）等。

图2 二至丸候选化合物与糖尿病脱发共同靶点PPI网络图

表3 二至丸候选化合物与糖尿病脱发共同靶点蛋白Degree值

2.5 共同靶点GO、KEGG 注释信息及富集通路结果48 个共同靶点GO 富集分析得到CC14 个、BP59个、MF13 个，取PValue 值的负对数（-lgP），-lgP值越大表示富集程度越高，依据-lgP值对CC、BP、MF分别取前10 位构建气泡图，其中气泡的大小取决于Count值，X轴为关联基因数与GO富集分析上总基因数的比值(Gene Ratio)，Y轴为CC、BP、MF的-lgP前10的靶点名称，见图3。结果发现：共同靶点主要分布于质膜、细胞外基质、细胞质核周区域等细胞成分中，通过类固醇结合、配体激活的序列特异性DNA结合、ATP结合、雌激素激活的序列特异性DNA 结合、去甲肾上腺素结合、肾上腺素结合等方式，参与蛋白质磷酸化、RNA聚合酶II启动子调控、丝氨酸磷酸化、DNA复制、MAP激酶反馈机制调控、神经元的凋亡过程、基因表达调控等生物进程，从而发挥治疗糖尿病脱发的作用。

图3 二至丸候选化合物与糖尿病脱发共同靶点GO富集分析

48 个共同靶点KEGG 富集分析得到80 个信号通路，根据-lgP值取富集程度前20 的信号通路[25]，见表4。同时将富集程度排名前20 位的通路相关信息导入Cytoscape3.7.1 构建共同靶点-通路网络图，其中红色菱形代表信号通路、绿色长方形代表共同靶点，见图4。结果发现：共同靶点参与的通路以癌症途径（包括蛋白聚糖、碳代谢）、催乳素信号通路、HIF-1 信号通路、Rap1信号通路、Ras信号通路、PI3K-Akt信号通路等为主。由此表明，二至丸主要通过以上通路发挥治疗糖尿病脱发的作用。

图4 二至丸候选化合物与糖尿病脱发共同靶点-通路网络图

表4 二至丸候选化合物与糖尿病脱发共同靶点KEGG通路富集分析结果

3 讨论

二至丸具有滋肾养肝、乌须发的功效，是传统的平补肝肾之良方。本研究通过对二至丸中墨旱莲、女贞子的活性成分的收集和筛选，得到具有较高活性的候选化合物23 个，部分活性成分已被证实具有调节糖类和脂肪代谢等功能，如亚麻酸（Linarin）可降低血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST），减轻肝损伤，从而降低血脂，韦地内酯（wede⁃lolactone）亦通过ERK（细胞外调节蛋白激酶）途径抑制人脂肪组织来源的间充质干细胞（hAMSCs）的脂肪形成分化，有利于血液的流通，促进血液循环，利于头部供血提供营养[27-28]，槲皮素（quercetin）可减少脂质过氧化，抗血小板聚集和提高毛细血管通透性，滑石粉（Taxifolin）通过体外抑制Aβ纤丝的形成，改善脑血流量，同时具有抗氧化和抗糖化活性的功能[2,29-31]。

通过Degree 值预测出二至丸改善糖尿病脱发作用的前10 位的重要靶点分别为：AKT1、SRC、HRAS、EGFR、STAT3、TNF、PIK3CA、FN1、MTOR、ESR1，PPI网络图显示二至丸靶标与糖尿病脱发靶标之间存在着复杂网络关系。AKT1 参与胰岛素信号传导，内皮功能和代谢调节，通过调控细胞增殖和生长，参与葡萄糖代谢的细胞过程，保护内皮细胞和预防异常的血管通透性[32]；SRC 通过调节RAS/ERK 途径的活性[33]，HRAS 通过调控RAS/MAPK 信号通路途径[34]，EGFR激活导致受体酪氨酸激酶的自磷酸化启动下游信号通路[35]，影响细胞的增殖从而在糖尿病脱发的病理过程中发挥作用；PIK3CA 的突变可提高PI3Ks 活性，从而使细胞内含有PH 结构域的信号蛋白AKT 和PDK1(phosphoinositide dependent kinase-1)结合,促使PDK1磷酸化AKT 蛋白的Ser308 导致AKT 活化，调节细胞的功能，减少细胞凋亡[36]。此外，二至丸还可以通过STAT3、TNF发挥抗炎作用保护血管的通透性，维持血液循环的畅通，炎症是使血管粥样硬化的重要驱动力，STAT3通过促进白细胞介素-6（IL-6）分泌[37]，TNF促进T细胞的活化和增殖[38]，调节免疫应答，发挥抗炎的作用。因此，二至丸可通过调节上述靶蛋白发挥调节胰岛素代谢、抗炎、调节细胞增殖，保护血管通透性等作用防治糖尿病脱发。

GO 富集分析表明，二至丸防治糖尿病脱发的靶点存在于多种细胞成分，通过多种方式参与蛋白质磷酸化、DNA复制、基因表达调控等生物过程，从而调节体内代谢[39]，调节细胞生长、分化、凋亡，通过改善内分泌代谢紊乱、血液循环等在防治糖尿病脱发的过程中发挥重要作用。

KEGG 富集通路分析显示，共同靶点可通过催乳素信号通路、HIF-1 信号通路、Rap1 信号通路、Ras 信号通路等方式改善糖尿病脱发。已有研究发现:催乳素（PRL）作为激素和细胞因子在垂体、免疫系统等组织合成，其信号通路通过跨膜催乳素受体（PRL-R）发生，参与体内代谢，影响繁殖、控制营养细胞的动态平衡、调节免疫系统[40-42]；HIF-1可参与体内糖代谢和影响血管生成的蛋白（如血管内皮生长因子和促红细胞生成素）的表达[43]；血小板是发挥止血功效的重要成分，RAP1是影响血小板粘附的关键，能通过感应细胞质的微小钙浓度变化，发挥调节血小板的粘附性的作用，从而保持血管的通透性，调节血液循环[44]；RAS 通过参与控制细胞的过程，影响细胞的增殖、迁移[45]，从而发挥改善糖尿病脱发的作用。李春梦[46]等网络药理学研究还发现二至丸可通过调节Regulation of ac⁃tin cytoskeleton、Insulin signaling pathway 等信号通路，影响细胞迁移、改善胰岛素抵抗而发挥治疗糖尿病肾病的作用，与本研究预测靶点契合。

网络药理学的多靶点、多通路的药物分子设计模式，其整体性、系统性的特点与中医药提倡的整体观、辨证论治原则相统一。本研究通过网络药理学方法得到了二至丸改善糖尿病脱发的作用靶点及其通路，初步揭示了二至丸治疗糖尿病脱发的作用机制，为临床及相关实验研究提供了依据。