circLMNB1诱导调控内质网应激介导结直肠癌转移发生

何春萍 黄超 周瑞 孙军 阮鹏 于红刚 姚涛

武汉大学人民医院1消化内科，2神经内科（武汉430060）

结直肠癌（CRC）是最常见的恶性肿瘤之一［1］，超过50%的CRC患者将在其一生中发生肝转移［2］。目前对于转移性晚期CRC 尚无有效治疗方法。绝大多数CRC 病例是散发性的和非遗传性的［3］。大量的CRC 零星的肿瘤前病变逐渐积累了遗传和表观遗传修饰，使细胞增殖和存活不受控制，并逐步发展成为具有典型的浸润和转移特性［4］。了解这些转变的分子机制，对于优化CRC 的治疗策略非常重要。环状RNA（circRNA）是一种保守且稳定的共价闭合的RNA，它可能是潜在的疾病标志物［5］。ZENG 等［6］发现，circHIPK3 在结直肠癌的生长与转移过程中起到关键的调控作用。越来越多的研究聚焦于内质网应激在肿瘤中的作用。内质网应激被证明可诱发细胞凋亡［7］。肿瘤的发生发展与细胞的内质网应激失调存在相关性［8］。内质网应激的激活可以诱导CRC 细胞凋亡，抑制肿瘤发生与发展［9］。而circRNA 与内质网应激之间存在调控关系。circHIPK2 可通过调控内质网应激机制，控制星形胶质细胞的激活［10］。然而，目前在结直肠癌中，通过circRNA 调控内质网应激机制，干预肿瘤发生进展的鲜有报道。本研究首先对circLMNB1 在CRC 组织和癌旁组织及细胞系中的表达特征进行探索，随后，在CRC 细胞中对circLMNB1 表达进行干预，进而检测细胞的迁移和侵袭能力，同时对内质网应激机制进行探索。本研究将明确circLMNB1 在结直肠癌的作用机制，为结直肠癌的治疗提供潜在的分子靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料研究收集2017年4月至2018年5月武汉大学人民医院胃肠外科20 例结直肠癌患者结直肠癌组织，并同时收集患者癌缘（3 ～5 cm）处组织作为癌旁组织。病例年龄在40 ～75 岁之间。纳入标准：a.经病理及影像检查确诊为结直肠癌；b. 未合并其他结直肠疾病；c. 未合并其他肿瘤；d.术前无放化疗史。排除标准：a. 病理确诊排除结直肠癌；b.合并其他肿瘤；c.术前经放化疗。研究开展前，经武汉大学人民医院伦理审查委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂和细胞系实验中所采用的结直肠癌细胞系LoVO 和HCT116 均购于中科院细胞库。circLMNB1 siRNA 由苏州吉玛生物设计并合成，circLMNB1 过表达载体pcircRNA2.2 由广州伯信生物提供，用于细胞培养的RPMI 1640 细胞基础培养基购自赛默飞旗下品牌Gibco，Transwell 小室由美国康宁公司提供。CHOP（A00311），ATF6（A00655）和GAPDH（A00227）一抗由博士德生物提供，HRP标记的山羊抗兔（ab6721）二抗由Abcam 公司提供。

1.3 细胞培养复苏后的细胞，培养于含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基中，在5%CO2、37℃、饱和湿度的培养箱培养，2 d 更换一次培养基。当密度达到85%以上时，进行细胞传代。

1.4 免疫印迹加入RIPA裂解液到细胞中充分混匀，于冰上裂解30 min 后离心，获得总蛋白液。测得样品总蛋白含量后，计算上样量。取20 μg 总蛋白进行SDS-PAGE 凝胶电泳，经转膜、5%脱脂奶粉封闭后，依次进行一抗孵育过夜、TBST 洗涤3 次、二抗室温下孵育1 h，随后进行显色和曝光。

1.5 Transwell 迁移和侵袭实验培养板中加入胰蛋白酶处理后制备单细胞悬液，接种到上室，并放入培养箱中进行培养。实验结束后，取出小室进行固定和染色。取下小室底置于载玻片上，中性树脂封片，观察记录多个视野下的迁移和侵袭的细胞数目。所有实验重复三次。

1.6 实时荧光PCR取50 mg 大小临床组织或5×105个细胞，进行总RNA 的提取。使用TRIzol 方法提取组织或细胞中的总RNA，并将提取的总RNA逆转成为cDNA。cDNA 模板采用如下引物进行qRT-PCR 实验。GAPDH：F，5′-CCAGCCGAGCCACATCGCTC-3′；R，5′-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′。circLMNB1：F，5′-GCCAAAATTGAATGCTGTCC-3′；R，5′-TGAGATAGCCCAGCAATCCT-3′。以GAPDH 的表达为内参，计算circLMNB1 相对表达水平。

1.7 患者临床特征分析对纳入的结直肠癌患者的基本信息及临床特征，包括性别、年龄、肿瘤大小、转移情况及TNM 分期情况。

1.8 统计学方法采用SPSS 22.0 进行数据分析。两组间数据分析采用t检验方法；多组间统计分析采用单因素方差分析进行差异分析。计量数据采用均数±标准差表示，使用Graphpad 8.0 作图。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circLMNB1 的表达特征qRT-PCR 结果显示，circLMNB1 在结直肠癌患者的癌组织中表达水平显著高于癌旁组织（P＜0.01，图1A）。另外，circLMNB1 表达水平与临床患者特征之间的关系分析见表1。

表1 CRC 患者特征Tab.1 Features of patients with CRC 例

circLMNB1 表达水平与年龄和性别均不存在显著性的差异（P＞0.05）。而肿瘤大小、转移情况均与circLMNB1 表达水平存在显著的相关性（P＜0.05）。然而，TNM 分期与circLMNB1 表达并不存在相关性（P＞0.05）见表1。

同时，在人正常结直肠粘膜细胞FHC和结直肠癌细胞系HCT116 和LoVo 中，circLMNB1 的表达水平也存在显著差异。circLMNB1 在LoVo 和HCT116细胞系中的表达水平较FHC 细胞显著上调（P＜0.05）。见图1B。

图1 circLMNB1 在结直肠癌临床组织和细胞系中的表达特征Fig.1 Expression characteristics of circLMNB1 in Clinical tissues and Cell Lines of Colorectal Cancer

2.2 circLMNB1 对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响分别采用circLMNB1 和circLMNB1 siRNA转染细胞，以对circLMNB1 进行过表达和干扰表达（图2A）。在HCT116 进行circLMNB1 过表达后，其迁移和侵袭能力均出现显著增强（P＜0.05）；而在LoVo 细胞中，采 用siRNA 对circLMNB1 进行敲降后，细胞的迁移和侵袭能力均显著减弱（P＜0.05）。

图2 circLMNB1 对结直肠癌细胞迁移、侵袭能力的影响Fig.2 Cell migration and invasion was changed by circLMNB1 knockdown or overexpression in CRC cell line

2.3 circLMNB1 对结直肠癌细胞内质网应激机制影响在HCT116 中对circLMNB1 进行过表达后，CHOP 和ATF6 的表达水平出现显著的下调；而在LoVo 细 胞中，使 用siRNA 对circLMNB1 进行表达干扰后，CHOP 和ATF6 的表达水平则出现显著的上调（图3）。

图3 circLMNB1 对结直肠癌细胞内质网相关蛋白CHOP 和ATF6 表达水平影响Fig.3 Expression of CHOP and ATF6 was changed by circLMNB1 knockdown or overexpression in CRC cell line

3 讨论

circRNAs 是一种通过选择性剪接形成的内源性RNA，广泛分布于真核细胞中［11］。环状RNA 由于其封闭的环状结构，不易被内切酶降解，比线性RNA 更稳定［12］。目前被当作肿瘤诊断标记物而进行广泛的研究［13］。如has_circRNA_102209 被证明其在结直肠癌中表达上调，并可通过miR-761对肿瘤的增长与转移进行调控［14］。本研究结果发现，circLMNB1 在结直肠癌组织中的表达较癌旁组织高，同时，在结直肠癌细胞系中的表达水平较正常细胞高；进一步的分析初步得知，circLMNB1表达水平与患者肿瘤的大小、转移情况存在显著的相关性，但仍有待进一步扩大样本，进行综合分析。

内质网应激被证实参与结直肠癌的转移过程［15］。内质网建立了独特的方式来对抗应激，统称为未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）［16］。在应对来自外界的刺激时，细胞通常通过一系列的信号分子进行调控，如ATF6、CHOP等［16］。研究表明，ATF6/CHOP 信号参与内质网应激调控，并诱导细胞发生凋亡［17］。XU 等［18］的研究证实，FOXD3 可通过激活内质网应激，促进结直肠癌细胞的凋亡。HUANG 等［19］的最新研究表明，TSPYL5 可通过诱导内质网应激CHOP 等内质网相关蛋白表达，促进结直肠癌细胞的凋亡，抑制细胞的迁移、侵袭等生物学行为。本研究发现，circLMNB1 的过表达引起结直肠癌细胞内质网应激变弱，同时伴随迁移和侵袭能力增强。但是对circLMNB1 进行干扰，内质网应激则增强，同时，细胞迁移和侵袭能力变弱。结果表明，circLMNB1 可以调控内质网应激，具有潜在的调控肿瘤细胞迁移和侵袭能力的作用。

总之，circLMNB1 可作为结直肠癌诊断的生物标记物，它可能通过抑制内质网应激的方式参与结直肠癌的发生与进展。circLMNB1 的这种潜在价值，有望成为临床诊断的标记物及治疗靶标。