栀黄消瘀止痛膏中栀子苷含量测定*

2021-07-15鲁明明林新艳邬学群许金海范赵翔殷书梅

中国药业 2021年13期

鲁明明，林新艳，邬学群，莫文，许金海，范赵翔，龚丽，殷书梅 △

（1. 江苏康缘阳光药业有限公司，江苏南京 210046； 2. 上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032）

栀黄消瘀止痛膏由栀子、大黄、木瓜等多味中药组方，配以饴糖搅拌赋型而成，具有活血化瘀、消肿止痛功效，临床用于治疗踝、膝、肘、腕等关节的跌打损伤、急性

软组织损伤，疗效较好［1－2］。原剂型采用传统工艺制成，难以满足清洁性及低过敏性等要求，不便于携带保存，使应用受到限制，工艺改良后制成了橡胶膏。栀子味苦、性寒，为方中君药，功效见于《神农本草》、后续本草及历版《中国药典》［3－4］，能泻火除烦、清热利湿、凉血解毒，且对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌及皮肤致病癣菌均有广谱抗菌作用［5］。其有效成分是以栀子苷（别名京尼平苷）为代表的环烯醚萜苷类及有机酸酯类成分［3］，具有解热、镇痛、利胆、抗炎、缓泻、治疗软组织损伤等作用［6－12］。本研究中建立了测定新型栀黄消瘀止痛膏中栀子苷含量的方法，以确保产品质量、临床应用的安全性及有效性。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200 型高效液相色谱仪（配有四元泵、可变波长扫描紫外检测器，日本安捷伦科技有限公司）；Mettler AG135 型电子天平、Mettler AB135S 型电子天平（梅特勒－托利多＜上海＞有限公司，精度均为十万分之一）；HH－2 型恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；KQ－500DE 型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司，功率为500 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

栀子苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110749 －201919，纯度为 97.1%）；栀黄消瘀止痛膏（江苏康缘阳光药业有限公司，批号分别为200501，200502，200503）；甲醇（批号为 200106022H），乙醇（分析纯，批号为200211160H），均购自南京化学试剂股份有限公司；乙腈（色谱纯，美国天地有限公司，批号为19025118）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验［13 －14］

色谱柱：岛津 WondasilC18－WR 柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈－水（10∶90，V／ V）；流速：1.0mL／min；检测波长：238 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。理论板数按栀子苷峰计不低于1 500。在此色谱条件下的色谱图见图1。由于栀子苷为样品栀子中的独有成分，故未进行阴性对照试验。

图1 高效液相色谱图1.geniposideA.Reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

2.2 溶液制备［15］

取样品贴膏2 片，除去盖衬，将药膏刮下，混合均匀，取1 g，精密称定，加入50 mL 甲醇，称定质量，超声提取50 min，冷却后称定质量，用甲醇补足减失的质量，将溶液摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含30 μg的溶液，即得对照品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察：取栀子苷对照品适量，精密称定，置100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成每1 mL 含15.1 mg 的对照品贮备液；精密吸取对照品贮备液适量，以甲醇稀释，配制成质量浓度为7.55，15.10，30.20，75.50，151.00 μg ／mL 的系列对照品溶液。按2.1 项下色谱条件各进样10 μL，重复2 次，测定峰面积，以对照品溶液进样质量浓度（X，μg／mL）为横坐标、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得栀子苷的回归方程 Y ＝ 15.708 X － 26.668（ R2＝ 0.999 4，n ＝10）。结果栀子苷的质量浓度在 7.55 ～151.00 μg／mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取同一栀子苷对照品溶液（质量浓度为 30.20 μg ／mL）6 份，按 2.1 项下色谱条件进样10 μL，测定峰面积。结果峰面积的平均值为451.10，RSD 为 1.52%（n ＝ 6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品1 g，精密称定，平行6 份，依法制备供试品溶液，并进样测定含量。结果栀子苷含量的平均值为 1.59 mg ／g，RSD 为 0.92% （n ＝ 6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取重复性试验项下供试品溶液适量，分别于 0，2，4，8，12，24 h 时进样 10 μL 测定。结果栀子苷峰面积的平均值为 494.98，RSD 为 1.53% （n ＝ 6），表明供试品溶液在24 h 内稳定。

加样回收试验：取样品（栀子苷含量为1.59 mg／g）1 g，精密称定，平行9 份，每3 份为1 组，分别按含栀子苷 0.5，1.0，1.5 mg ／g 准确加入栀子苷对照品溶液，制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 栀子苷加样回收试验结果（n ＝9）Tab.1 Results of the recovery test of geniposide（n ＝9）

2.4 样品含量测定

取 3 批（批号分别为 200501，200502，200503）样品各1 g，精密称定，依法制备供试品溶液，进样测定，并计算栀子苷的含量。结果3 批样品中栀子苷的含量分别为1.61，1.61，1.62 mg ／g。中药材质量受产地、季节、采收期等诸多因素影响，故栀子药材的栀子苷含量存在偏差，结合以上3 批样品含量测定结果，拟暂定栀黄消瘀止痛膏所含栀子苷的含量不低于1.45 mg／g。

3 讨论

3.1 超声提取溶剂和提取时间选择

考察了2 种超声提取溶剂（甲醇和乙醇）对提取结果的影响。结果，采用甲醇超声处理的供试品溶液的色谱峰可完全分离，乙醇制备的供试品溶液的色谱图中，栀子苷色谱峰与其他成分无法有效分离，且峰形较差，故选择提取溶剂为甲醇。考察了不同超声提取时间（30，40，50，60 min）对提取结果的影响。结果，50 min 和 60 min时栀子苷的提取率和提取效率基本一致，且均高于30 min 和40 min，从节约能源、提高工作效率方面考虑，故最终选择超声提取时间为50 min。

3.2 色谱条件选择

考察了不同流速（0.8，0.9，1.0，1.1 mL ／min）对提取结果的影响，结果供试品溶液中栀子苷峰在上述4 种流速下均能较好分离，表明不同流速条件下的耐用性均较好。考察了不同柱温（30，35，40 ℃）对提取结果的影响，结果供试品溶液中栀子苷色谱峰在上述3 种柱温下均能较好分离，表明不同温度条件下的耐用性均较好。考察了不同流动相比例［乙腈－水（15 ∶85，V ／ V）、乙腈－水（12 ∶88，V ／ V）、乙腈－水（10 ∶90，V ／ V）］对提取结果的影响，结果流动相为乙腈－水（10 ∶90，V ／ V）时栀子苷的分离效果和峰形均较好。考察了不同品牌的色谱柱（Kromasil 100－5－C18柱，Epic C185u 柱，Wondasil C18－WR 柱）对提取结果的影响，结果分离度、理论板数均能满足要求。