不同产地茺蔚子饮片超高效液相色谱指纹图谱研究*

吴世蓉，张 波△，吴文平，李国卫

（1. 安徽省中医院，安徽 合肥 230031； 2. 广东一方制药有限公司·广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 广州 528244）

茺蔚子为唇形科植物益母草 Leonurus japonicus Houtt. 的干燥成熟果实，性微寒，味苦、辛，有活血调经、清肝明目之功效，临床多用于治疗月经不调、经来腹痛、目赤翳障等证［1］。其化学成分主要包括生物碱、黄酮类、二萜类、强心苷等［2－3］。已有文献报道茺蔚子的质量控制方法，但多集中于茺蔚子中盐酸水苏碱的含量测定，对药材的指纹图谱研究较少［4－5］。茺蔚子在全国各地均有分布和种植［6］，市售品产地众多，质量不一，采用单一成分的含量测定方法来评价，不能全面反映其整体质量。本研究中采用超高效液相色谱（UPLC）法对不同产地茺蔚子饮片进行指纹图谱研究，旨在为更加科学地制订茺蔚子饮片的质量控制标准提供有效依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters H－Class 型超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；HWS28 型恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；ME204E 型电子分析天平（精度为 0.1 mg），XP26 型电子分析天平（精度为 0.001 mg），均购自梅特勒－托利多国际贸易（上海）有限公司。

1.2 试药

4－羟基苯甲酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号为101149－201903，含量为 100.0%）；甲醇、乙腈、三氟乙酸均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水；18 批茺蔚子饮片（市售品），经安徽省中医院李立华主任中药师鉴定为正品，产地及编号见表1。

表1 18 批茺蔚子饮片的产地信息Tab.1 Producing habitats of 18 batches of Leonuri Fructus

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：WatersHSST3柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相：乙腈（A）－0.1% 三氟乙酸溶液（B），梯度洗脱（0 ～ 3 min 时 0 A，3 ～ 15 min 时 0 A→4%A，15 ～ 22 min时 4%A→6%A，22 ～ 25 min 时 6%A→9%A，25 ～28 min 时 9%A →10%A，28 ～ 40 min 时 10%A，40 ～40.1 min 时 10%A→80%A，40.1 ～45 min 时 80%A）；流速：0.30 mL ／min；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃。

2.2 溶液制备

称取4－羟基苯甲酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为20 μg／mL 的对照品溶液。取药材饮片样品粉末（过50 目筛）约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇100 mL，称定质量，加热回流30 min，静置，冷却至室温，再次称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

精密度试验：取2.2 项下供试品溶液适量，按2.1项下色谱条件进样测定6 次，以4－羟基苯甲酸峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积。结果各共有峰相对保留时间和相对峰面积的 RSD 均小于3% （ n ＝ 7），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2 项下供试品溶液适量，分别于室温下放置 0，2，4，6，8，12，24 h 时按 2.1 项下色谱条件进样测定，以4－羟基苯甲酸峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积。结果各共有峰相对保留时间和相对峰面积的 RSD 均小于3%（ n ＝7），表明供试品溶液在室温放置24 h 内基本稳定。

重复性试验：取药材饮片样品（编号为S1）适量，各6 份，按 2.2 项下方法制备供试品溶液，再按 2.1 项下色谱条件进样测定。以4－羟基苯甲酸峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积。结果各共有峰相对保留时间和相对峰面积的 RSD 均小于3%（ n ＝ 6），表明方法重复性良好。

2.4 指纹图谱研究

指纹图谱建立：取茺蔚子饮片18 批，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，18批茺蔚子饮片的指纹图谱见图1。将色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.0 版）”软件，与对照图谱进行自动匹配，即得对照指纹图谱，详见图2。标定共有峰13 个，各批样品的共有峰峰面积见表2。通过与对照品比对，鉴定出1 个主成分，详见图3。

表2 18 批茺蔚子饮片超高效液相色谱图共有峰的相对峰面积Tab.2 Relative peak areas of common peaks in 18 batches of Leonuri Fructus by UPLC

图1 18 批茺蔚子饮片超高效液相色谱图叠加指纹图谱Fig.1 UPLC superimposed fingerprints of 18 batches of Leonuri Fructus

图2 茺蔚子饮片超高效液相色谱图对照指纹图谱Fig.2 UPLC reference fingerprint of Leonuri Fructus

图3 对照品溶液高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of the reference solution

相似度计算：将18 批茺蔚子饮片的指纹图谱均导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.0 版）”软件，计算相似度。结果18 批饮片与对照指纹图谱的相似度范围为 0.801 ～0.982，仅玉林市的 3 批与对照指纹图谱相似度小于0.88（表3），表明各产地饮片质量较接近。

表3 18 批茺蔚子饮片指纹图谱相似度评价结果Tab.3 Similarity evaluation of fingerprints of 18 batches of Leonuri Fructus

聚类分析：采用SPSS 20.0 统计学软件分别对18批茺蔚子饮片进行聚类，采用组间平均数联结法，以夹角余弦作为相似度的判定公式。结果，18 批饮片样品聚为 3 类，Ⅰ类包括 S7，S8，S16，S17，S18（信阳市 2 批、临沂市 3 批）；Ⅱ类包括 S1，S2，S3，S4，S5，S6，S12，S13，S14，S15（绥化市 4 批、信阳市 3 批、南阳市 3 批）；Ⅲ类包括 S9，S10，S11（均来自玉林市）。详见图 4。

图4 18 批茺蔚子饮片聚类分析结果Fig.4 Results of cluster analysis of 18 batches of Leonuri Fructus

共有峰主成分分析：采用SPSS 20.0 统计学软件分别对18 批茺蔚子饮片指纹图谱所得的13 个共有峰进行主成分分析，得出相关矩阵的特征值及其方差，详见表 4。可见，前 3 个成分的特征值分别为 6.446，2.124，1.437，对总方差的累计贡献率达76.981%，基本保留了原样本的信息，故确定提取的主成分有3 个。主成分1 主要影响因素为色谱峰 4，10，12，主成分 2 为色谱峰2，3，主成分 3 为色谱峰 6，7，故用前 3 个主成分即可表示原UPLC 数据的主要信息，详见表5。权重值的前3 名变量分别为 0.942，0.933，0.887，对应色谱峰 12，4，10，即为判断不同产地茺蔚子饮片质量的重要因素。

表4 特征根、各主成分的贡献率Tab.4 Contribution rate of characteristic root and each principal components

表5 各因子初始因子载荷矩阵Tab.5 Initial factor load matrix of each factor

不同产地茺蔚子饮片综合评价：针对前3 个主成分对茺蔚子饮片进行综合评价，按方差贡献率加权计算综合得分，结果见表6。排名前5 的样品中包括临沂市的3批和信阳市的2 批；排名前5 ～10 的样品中包括绥化市的3 批和信阳市的2 批。总体来说，临沂市的茺蔚子饮片质量较优且稳定；玉林市的整体质量较差，综合排名靠后；南阳市的质量一般且稳定；信阳市的质量不是很均匀，有优有劣。由三维得分散点图可知，18 批饮片可分为 3 类，其中，Ⅰ类包括 S7，S8，S16，S17，S18（信阳市2 批、临沂市 3 批）；Ⅱ类包括 S1，S2，S3，S12，S13，S14，S15（绥化市 4 批、南阳市 3 批 ）；Ⅲ类包括 S4，S5，S6，S9，S10，S11（玉林市、信阳市各 3 批）。详见图 5。

表6 主成分得分、综合得分及排序Tab.6 Principal components scores，comprehensive scores and their ranking

图5 主成分三维得分散点图Fig.5 3D scatter plot of principal components

3 讨论

3.1 供试品制备方法及液相色谱条件优化

预试验中对不同提取溶剂（无水甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇）的提取效果进行了比较，结果70%甲醇提取的色谱峰信息更丰富，峰面积响应值较高且基线相对平稳。对不同提取方式（超声提取、加热回流提取）、不同提取时间（15，30，60 min）的考察结果表明，加热回流提取30 min 的提取效果较好。前期研究中发现，茺蔚子的化学成分较丰富，考虑采用HPLC 法的分析时间可能较长，故采用UPLC 法分析，通过对条件进行优化，最终在45 min 内完成对图谱的分析，并确定13 个共有峰，在保证全面反映茺蔚子饮片全貌的前提下，提高了分析效率。

3.2 特征图谱测定结果

目前，茺蔚子的研究主要针对茺蔚子的生物碱、氨基酸、脂肪酸等成分进行分析［5，7－11］。本研究中通过建立茺蔚子饮片UPLC 指纹图谱，对茺蔚子饮片的成分进行了较全面地分析，18 批茺蔚子饮片与对照指纹图谱的相似度范围为 0.801 ～0.982，15 批饮片与对照指纹图谱的相似度在0.88 以上，为不同产地茺蔚子饮片的质量评价提供了参考。2020 年版《中国药典（一部）》茺蔚子项下规定的含量测定指标为盐酸水苏碱，预试验中未找到与盐酸水苏碱对照品保留时间一致的色谱峰，通过与现有文献比对，推测可能原因是盐酸水苏碱为末端吸收，检测波长多以192 nm 为主，本研究中为能反映茺蔚子饮片的整体成分，选择了色谱峰信息较丰富的254 nm作为检测波长。另外，盐酸水苏碱在茺蔚子中的含量较低，药典检测方法中需经中性氧化铝柱纯化富集，本研究为全面反映茺蔚子饮片质量的全貌，故采用超声提取。本研究中通过对照方式确定了1 个成分，即4－羟基苯甲酸，最终确定为参照峰，提高了方法的专属性和耐用性。

3.3 聚类分析及主成分分析结果

以往对中药材样品仅进行含量测定或指纹图谱等常规化学试验分析，易忽略中药材质量与其性状、产地、采收、加工等因素的关联，近年来，通过化学计量学方式能进一步挖掘中药材的质量与性状、产地、采收、加工等因素间的联系，为中药材的质量研究提供了新的分析手段。本研究中在建立茺蔚子饮片UPLC 指纹图谱的基础上，通过聚类分析、主成分分析进一步挖掘样品质量与产地间的关联。结果表明，茺蔚子饮片不同产地间存在显著差异，建立的化学识别模式可对不同产地的茺蔚子饮片进行科学评价，不同产地茺蔚子饮片大致可分为3 类，其中临沂市所产的茺蔚子饮片在2 种评价方法中均能稳定地分为1 类，且主成分综合评分排名靠前，说明该产地饮片样品质优且稳定；而玉林市的3 批样品排名靠后，原因可能与茺蔚子饮片产地的南北分布有关。该结论与多项研究结果［4，12－16］基本一致，说明所建立的方法具有一定的科学性和合理性，可用于茺蔚子饮片的质量评价。

3.4 方法评价

本研究中共收集了全国5 个不同产地共18 批茺蔚子饮片，样品具有一定的代表性，基本可反映茺蔚子饮片的整体性与差异性。中药饮片质量易受生长环境、土壤性质、气候等因素影响，因此，通过运用聚类分析、主成分分析等评价手段，建立全面、客观、科学的茺蔚子质量评价方法，可为茺蔚子饮片的真伪鉴别和质量控制提供参考。