不同方法提取陈皮中黄酮类有效成分含量比较

2021-07-15张婷婷

中国药业 2021年13期

张婷婷，梁燕，彭灿，3△

（1. 安徽中医药大学第一附属医院药学部，安徽合肥 230031； 2. 安徽中医药大学药学院，安徽合肥 230012； 3. 安徽中医药大学药学院中药复方安徽省重点实验室·安徽道地中药材品质提升协同创新中心，安徽合肥 230012）

陈皮为芸香科植物橘 Citrus reticulata Blanco 及其栽培变种的干燥成熟果皮，味苦、辛，性温，归肺、脾经，用于脘腹胀满，食少吐泻，咳嗽痰多［1］。陈皮在我国分布广泛，来源众多，主要药理作用有抗氧化［2］、抗炎［3］、抗心脑血管疾病［4］、抗癌［5］、调节脂质代谢［6］等，主要化学成分为黄酮类［7］、挥发油类［8］、生物碱类成分及微量元素等。黄酮类化合物是陈皮中的主要活性成分，橙皮苷为陈皮中含量最高的黄酮类物质。陈皮中其余黄酮类物质有新橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷、桔皮素、川陈皮素等［9］。目前，陈皮的主要提取方法有 2015 年版《中国药典（四部）》中收录的索氏提取与加热回流结合的方法和超声提取法。本研究中在橙皮苷的基础上增加了桔皮素和川陈皮素多甲氧基黄酮类成分作为测定指标［10］，比较2 种提取方法提取陈皮中黄酮类成分的差异，为陈皮的有效成分提取和质量控制提供依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Thermo Ultimate 3000 型高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技＜中国＞有限公司）；ST－528 型超微粉碎机（瑞安市赛特机电有限公司）；YL－060S 型超声波清洗机（深圳市语路清洗设备有限公司，功率为300 W，频率为40 kHz）；SHZ －D（Ⅲ）型循环水式多用真空泵（河南省予华仪器有限公司）；DF－101S 型集热式恒温磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；JY502 型电子天平（上海浦春计量仪器有限公司，精度为标准度三级）；BT25S 型电子天平（赛多利斯科学仪器＜北京＞有限公司，精度为十万分之一）。

1.2 试药

超纯水（自制）；甲醇、乙腈均为色谱纯，购自河北百灵威超精细材料有限公司；石油醚（分析纯，无锡市佳妮化工有限公司）；冰醋酸（分析纯，太仓市周氏化学品有限公司，批号为20180810JN）；橙皮苷标准品（批号为CHB－C－034，质量分数＞98%），川陈皮素标准品（批号为CHB－C－047，质量分数＞98%），桔皮素标准品（批号为CHB－J－046，质量分数＞98%），均购自成都克洛玛生物科技有限公司；陈皮药材产地分别为湖南省怀化市、湖北省宜昌市、山东省临沂市、浙江省丽水市、湖南省常德市，编号分别为 01，02，03，04，05。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Thermo C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）－2% 醋酸水溶液（B），梯度洗脱（0 ～14 min 时 85%B→67.5%B，14 ～20 min 时 67.5%B→43%B，20 ～ 25 min 时 43%B →33%B，25 ～ 30 min 时33%B→85%B）；流速：1 mL ／min；柱温：25 ℃；进样量：5 μL；检测波长：283 nm。在此色谱条件下，供试品溶液Ⅰ（索氏提取法）、供试品溶液Ⅱ（超声提取法）色谱图中，与混合标准品溶液色谱图中相同保留时间有相应色谱峰出现。详见图1。

图1 高效液相色谱图1. hesperidin 2.nobiletin 3. tangeretinA.Mixed standard solution B.Test solution Ⅰ（Soxhlet extraction method） C.Test solution Ⅱ （ultrasonic extraction method） D.Methanol blank solutionFig.1 HPLC chromatograms

2.2 溶液制备

供试品溶液：每个批次（共5 组）分别取100 g 陈皮药材，打粉，得粗粉，过3 号筛，备用。分别取各组粗粉1.000 0 g，精密称定，置索氏提取器中，加石油醚（60 ～90 ℃）80 mL，加热回流 2 ～ 3 h，弃去石油醚，药渣挥干，加甲醇80 mL，加热回流至提取液无色，放冷，滤过，滤液置100mL 容量瓶中，用少量甲醇分次洗涤容器，洗液倒入同一容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液Ⅰ（索氏提取法）。分别取1.000 0 g 各组粗粉，精密称定，置100 mL 具塞锥形瓶中，加入50 mL 甲醇，混匀，称定质量，超声提取30 min，称定质量，用甲醇补足减失的质量，过滤，留取滤液，即得供试品溶液Ⅱ（超声提取法）。

混合标准品溶液：分别取10.00 mg 橙皮苷、川陈皮素、桔皮素标准品，精密称定，加入10 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，即得。

2.3 方法学考察

线性关系考察：取2.2 项下混合标准品溶液1 mL，用甲醇分别稀释，配制成6 个质量浓度水平的待测样品溶液，其中橙皮苷标准品的质量浓度分别为1 000.0，500.0，100.0，50.0，25.0，12.5 μg／mL；川陈皮素和桔皮素的质量浓度均为 500，100，50，25，10，5 μg／mL，按2.1 项下色谱条件进样分析，重复3 次，以样品的质量浓度（X，μg／mL）为横坐标、平均峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，结果见表1。

表1 线性关系考察结果（n ＝3）Tab.1 Results of linear relation test（n ＝ 3）

精密度试验：取橙皮苷、川陈皮素、桔皮素质量浓度均为 100 μg ／mL 的对照品溶液，按 2.1 项下色谱条件每个样品日内连续进样6 次，连续考察3 d，记录峰面积，计算平均值。结果橙皮苷、川陈皮素、桔皮素日内及日间测得含量的 RSD 均小于2%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同批次陈皮6 份，依法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样分析，记录各组样品的峰面积，并计算含量。结果橙皮苷、川陈皮素、桔皮素含量的平均值分别为 4.52%，0.016%，0.012%，RSD 分别为 1.03%，0.97%，1.13%（n ＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取陈皮药材，依法制备供试品溶液，分别于 0，2，4，8，12，24 h 时按 2.1 项下色谱条件进样分析，记录峰面积，并计算橙皮苷、川陈皮素、桔皮素的含量。结果橙皮苷含量的 RSD 均不超过 2% （ n ＝ 6），表明供试品溶液在24 h 内稳定性较好。

加样回收试验：取已知含量的陈皮样品6 份，每份0.500 0 g，精密称定，分别加入橙皮苷、川陈皮素、桔皮素对照品粉末 1.190 0，0.161 9，0.108 5 mg，依法提取，得供试品溶液，取适量，按2.1 项下色谱条件进样检测，重复进样3 次，记录峰面积，取平均值并计算该条件下的加样回收率。结果的 RSD 分别为1.54%，1.96%，1.87% （ n ＝ 3），表明方法回收良好。

2.4 样品含量测定

取各批次陈皮样品，依法制备供试品溶液，每批样品重复进样3 次，按2.1 项下色谱条件测定含量，计算峰面积平均值及橙皮苷、川陈皮素、桔皮素的含量。详见表2。采用SPSS 21.0 统计学软件分析数据。先进行正态性检验（K－ S 检验和 W 检验），橙皮苷、川陈皮素和桔皮素含量测定结果的 W－检验和 K－ S 检验的 P 值均小于 0.05，故认为不满足正态性，故采用非参数Wilcoxon 检验。经分析表明，2 种提取方法对陈皮中橙皮苷、川陈皮素、桔皮素的提取率差异均有统计学意义P 值分别 0.045，0.000 018，0.000 024，每批药材超声提取的平均含量均大于索氏提取的平均含量。故认为超声提取法的提取率高于索氏提取法。

表2 2 种提取方法提取陈皮中黄酮类成分的含量测定结果（，%，n ＝ 3）Tab.2 Content determination of flavonoids in Pericarpium Citri Reticulatae by two extraction methods（，%，n ＝3）

样品编号01 02 03 04 05索氏提取法超声提取法橙皮苷4.588 3 ± 0.020 2 3.636 2 ± 1.266 8 3.313 5 ± 1.363 3 3.447 6 ± 1.951 9 2.965 5 ± 1.102 7川陈皮素0.016 2 ± 0.000 5 0.028 1 ± 0.032 8 0.024 4 ± 0.004 5 0.033 8 ± 0.004 2 0.060 1 ± 0.008 2桔皮素0.014 1 ± 0.000 5 0.019 5 ± 0.019 3 0.016 5 ± 0.002 4 0.023 3 ± 0.004 7 0.036 8 ± 0.006 0橙皮苷4.791 2 ± 0.014 8 3.742 1 ± 1.115 3 3.879 0 ± 1.598 4 3.366 7 ± 1.991 7 3.542 6 ± 1.594 1川陈皮素0.024 6 ± 0.000 3 0.042 2 ± 0.043 4 0.037 0 ± 0.003 2 0.050 8 ± 0.009 4 0.105 2 ± 0.014 5桔皮素0.021 8 ± 0.000 2 0.031 2 ± 0.033 5 0.026 6 ± 0.003 0 0.038 6 ± 0.006 7 0.077 7 ± 0.009 9

3 讨论

3.1 指标成分选择

2015 年版《中国药典（一部）》中采用单一成分橙皮苷的含量作为控制陈皮药材质量的指标，陈皮中橙皮苷的含量极高，但除橙皮苷外，多甲氧基黄酮类化合物也是陈皮中含量较高的活性物质，具有抗氧化［11］、抗癌［12－13］等药理作用。作为道地药材，部分广陈皮中橙皮苷的含量低于其他产地的陈皮，甚至有的不符合药典标准［14－15］，故单一成分并不能较好地反映药材的质量。

3.2 陈皮产地选择

影响中药材成分含量的因素包括来源品种、产地、药材的采集加工过程等。陈皮向来以广东新会陈皮为胜，但产自广东的陈皮中黄酮类成分的含量并没有显著高于其他产地的陈皮［16－18］。而且本课题组经过市场调研发现，产自广东的陈皮市场价远高于其他产地的陈皮。故本实验选择了除广东外的其他几个常见产地的陈皮。

3.3 色谱条件优化

本研究中以甲醇－醋酸－水（35 ∶4 ∶61，V ／ V ／ V）为流动相进行分离，结果色谱峰的分离效果差；曾考察以甲醇－1%醋酸溶液为流动相进行液相色谱检测，但分离效果仍较差；曾考察乙腈－1%醋酸溶液系统，以该系统洗脱色谱峰的分离效果并不好。故选取乙腈（A）－2% 醋酸溶液（B）作为流动相，梯度洗脱，每次进样5 μL。在肖建春等［19］的梯度洗脱程序基础上进行了优化，将进样时间由原来的1 h 缩短至30 min，节约了时间。最终确定梯度洗脱程序 0 ～14 min，85%B→67.5%B；14 ～ 20 min，67.5%B → 43%B；20 ～ 25 min，43%B →33%B；25 ～30 min，33B%→85%B。结果橙皮苷、川陈皮素、桔皮素3 个成分的色谱分离效果较好，其色谱峰与相邻色谱峰的分离度均在1.5 以上。

3.4 提取率分析

由表2 可知，超声提取法提取橙皮苷、川陈皮素、桔皮素3 种成分的提取率均高于索氏提取法。研究结果显示，对于川陈皮素，索氏提取法的提取率低于超声提取法［20］。川陈皮素和桔皮素均属于多甲氧基黄酮类成分，在黄酮母核 2 －苯基色原的 3，5，6，7，8，2′，3′，4′，5′，6′位上有4 个或4 个以上的甲氧基取代，这一结构特性决定其极性较弱，脂溶性好。由于索氏提取法中结合了石油醚脱色处理，导致川陈皮素在石油醚中溶解，导致提取率降低，这可能是索氏提取法中川陈皮素和桔皮素提取率低的主要原因；橙皮苷的含量较低，可能是橙皮苷在索氏提取过程中，在石油醚中有损耗。但具体原因仍需进一步探索。

3.5 2 种方法优缺点比较

索氏提取法具有明显的缺点：1）提取耗时长，且提取过程中需人工看护；2）根据样本量不同，需要大量的萃取溶剂；3）提取过程中通过加热提高了萃取效率，但对于一些热不稳定物质，提取结果在定量上是不完整的［21］。超声提取法的优点在于：1）节省溶剂，索氏提取法每批样品都要耗费80 mL 石油醚和100 mL 甲醇，而超声提取不需要石油醚；2）节约时间，超声提取法仅需30 min，而索氏提取法需要4 ～5 h，且超声提取可同时提取多份样品，更节省时间；3）对于陈皮中的有效成分（橙皮苷、川陈皮素、桔皮素），超声提取法提取更彻底。