混菌固态发酵白酒酒糟制蛋白饲料的研究

杨丽华， 张婷婷， 孟建宇

（内蒙古农业大学生命科学学院应用与环境微生物实验室，内蒙古呼和浩特010011）

我国是白酒酿造大国，每年白酒鲜酒糟的产量高达2400多万t，干糟产量可达约800万t（姚焰础等，2020），是一种廉价而优质的植物蛋白质原料。但目前白酒酒糟的主要用途为晾干后作为粗饲用或直接废弃，其含水量高，堆放时会有污水大量渗出，渗滤液中含有大量的高酸度污染物，会对环境造成严重污染（杨新等，2019；Ao等，2019）。然而，白酒酒糟中含有大量的营养物质，蛋白质含量是其他农作物的几倍，粗纤维含量较少，而且还含有多种维生素、氨基酸和微量元素等有益成分（刘志云等，2020；宋立立和刘苗，2020），是很好的蛋白质饲料原料来源（李建和叶翔，2013）。利用微生物发酵技术发酵酒糟生产高蛋白质饲料，是提高酒糟商业附加值，实现白酒酒糟大规模资源化利用，解决动物蛋白质饲料短缺，增加饲料领域经济效益的重要手段（胡志强等，2019；高铭坤等，2018）。

混菌发酵是通过两个或多个菌株之间的互惠共生作用，将粗纤维等生物大分子分解成动物易消化吸收的小分子的高效发酵技术（宋立立和刘苗，2020），显著优于单菌发酵。余乾伟等（2014）研究表明，混合真菌发酵可使蛋白饲料中粗蛋白质含量提高到29.8%。宋善丹等（2015）以米曲霉、黑曲霉和酵母菌混合发酵白酒糟发现，经发酵后各种氨基酸含量较发酵前明显提高。张玉诚等（2016）用四种混合菌固态发酵白酒糟发现，氨基酸含量提高了24.47%，蛋白质含量提高了57.85%。利用混菌发酵生产的动物蛋白饲料营养价值高，有效提高了蛋白质含量，明显降低了粗纤维素含量，极大减少了产气量，并且富含多种维生素、矿物质和生物活性物质等生理代谢不可缺少的营养元素（Rahman等，2016），利于动物消化吸收，具有非常广阔的市场前景（王蕴等，2020）。

1 材料与方法

1.1 试验材料 白酒酒糟：由内蒙古驰园酒业提供，含水量为73%，烘干后保存备用。

菌株：酵母菌为异常汉逊酵母J-1（Hansenula anomala J-1），纤维素降解菌为枯草芽孢杆菌K-2（Bacillus subtilis K-2）、解淀粉芽孢杆菌K-3（Bacillus amyloliquefaciens K-3）和柠檬酸菌N-10（Citrobacter sp.N-10），所用菌株均为本实验室前期筛得的菌种。

酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基（YPD培养基）：蛋白胨2%、葡萄糖2%、酵母提取物1%、琼脂2%，115℃灭菌35 min。羧甲基纤维素钠（CMCNa）固体培养基：CMC-Na 5.0 g、K2HPO41.0 g、Mg-SO40.5 g、（NH4）2SO42.0 g、NaCl 0.5 g、刚果红0.5 g、琼脂20 g。CMC-Na液体培养基：CMC-Na 10.0 g、K2HPO41.0 g、MgSO40.5 g、（NH4）2SO42.0 g、NaCl 2.5 g、牛肉膏2.5 g、胰蛋白胨5.0 g。产糖培养基：粉碎过80目筛的白酒酒糟10 g加到1 L蒸馏水中，115℃灭菌35 min。

1.2 菌种活化 将异常汉逊酵母J-1接种于YPD培养基中，30℃培养24 h；将枯草芽孢杆菌K-2、解淀粉芽孢杆菌K-3和柠檬酸菌N-10接种于CMC-Na固体培养基，30℃培养72 h。由于菌株在低温保藏期间活力会有较大的下降，所以本试验所用菌株均活化10代以上使用。其中，活化后的酵母菌接种于无琼脂的YPD培养基中，纤维素降解菌接种于CMC-Na液体培养基中30℃恒温振荡培养48 h后使用。

1.3 纤维素降解菌产糖试验 将纤维素降解菌接种于产糖培养基中，每隔一段时间对培养基中的糖含量进行测定，利用3-5二硝基水杨酸法（DNS法）绘制产糖曲线。

1.4 最佳接种条件的优化

1.4.1 纤维分解菌接种量的优化 分别接种0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%的纤维素降解菌于酒糟中，发酵24 h后接种0.3%酵母菌再发酵72 h，用血球计数板对酵母菌活菌数进行计数。

酵母菌活菌数的测定：将1 g发酵物溶于10 mL无菌水中，充分振荡后取1 mL上清液稀释50倍，用滴管滴1小滴于血球计数板计数室，再滴等体积的1%次甲基蓝溶液，沉淀染色3 min后进行活菌计数。

活菌数/mL=A/5×25×104×B；

面南岭，建经台；倚北阜，筑讲堂；傍危峰，立禅室；临浚流，列僧房。对百年之高木，纳万代之芬芳。抱终古之泉源，美膏液之清长。[10](《谢灵运传》，P1765)

式中：A为5个中格的平均菌数；B为稀释倍数，本试验中B=100。

1.4.2 酵母菌最佳接种时间的优化 接种0.6%的纤维素降解菌于酒糟中，用血球计数板分别测定发酵12、24、36、48、60 h时接种0.3%酵母菌发酵72 h后酵母菌的活菌数量。

1.5 发酵试验 将经上述处理过的酒糟与同时接种两种细菌、只接种一种细菌、不接种的样品形成对照，在酵母菌接种量为0.3%、含水率为40%、酒糟填料量为15 g、纤维素降解菌接种量为0.6%、发酵72 h的条件下，按照国标（GB 5009.5-2010）中的方法测定粗蛋白质的含量（林智，2010）。

2 结果与分析

2.1 纤维素降解菌产糖试验 菌株的生长与繁殖需要各种营养物质，其中最为关键的是糖类物质，然而酒糟中可被酵母利用的可溶性糖类在发酵中被大量消耗，直接使用酵母菌发酵蛋白饲料，其蛋白成分的上升空间极为有限。在本研究中，先分析纤维素降解菌的产糖能力，进一步确定是否使用该菌株进行发酵。各纤维素降解菌的产糖能力如图1所示。

图1 纤维素降解菌的产糖能力

由图1可以看出，发酵液在发酵初期的糖含量下降较快，在12 h时基本将发酵液中的糖分（其中的糖分全部由酒糟自身提供）消耗完毕，随后所有发酵体系中糖含量均有上升的趋势，其中菌株K-2与K-3的产糖较多，可见其对酒糟中纤维素分解能力较强。菌株K-2的产糖能力最强，所以将其用于后面的试验。

2.2 最佳接种条件的优化 为确定菌株K-2接种量对酵母菌J-1生长可能造成的影响，首先设置不同梯度的枯草芽孢杆菌K-2接种量接种于酒糟中，发酵24 h后接种0.3%酵母菌再发酵72 h，利用血球计数板对酵母菌进行计数，结果见图2。在确定菌株K-2最佳接种量后，需要进一步对酵母菌J-1接种于发酵体系的最佳时间进行优化，以确保酵母菌J-1可以进行最好的生长繁殖，图3是针对不同枯草芽孢杆菌K-2处理时间接种酵母菌培养72 h后酵母菌J-1数量的变化。

由图2和图3可知，高接种量的K-2菌或固态发酵体系经K-2菌长时间处理后，酵母菌J-1活菌数快速下降。这有可能是因为此时的枯草芽孢杆菌K-2成为了固态发酵体系中的优势菌群，从而抑制了酵母菌J-1的生长。0.6%K-2菌株的接种浓度比较适合J-1菌株的扩大培养。

图2 纤维素降解解菌接种量的优化

图3 酵母菌接种时间的优化

2.3 发酵试验 根据不同的发酵方式设置4个试验组与1个对照组，分别为经2.2优化处理过的酒糟组（A组），同时接种J-1和K-2组（B组），只接种K-2组（C组），只接种J-1组（D组）和不经过任何处理的酒糟对照组（E组），在酵母菌J-1接种量为0.3%、含水率为40%、酒糟填料量为15 g、纤维素降解菌K-2接种量为0.6%、发酵72 h的条件下，各组的粗蛋白质含量见图4。对照组的酒糟粗蛋白质含量为16.15%（干基），C组和D组的单菌发酵后粗蛋白质含量提高不明显，分别达到17.39%和18.23%，B组经过混菌发酵后粗蛋白质含量提高到了20.55%，而优化处理的试验A组粗蛋白质提高幅度最大，达到了25.91%。

图4 不同试验组粗蛋白质含量

3 结论与讨论

白酒是我国重要的传统食品，白酒的生产会产生大量的酒糟，有数据统计，每生产1 t白酒，将会有6～10 t酒糟产生（李觅等，2018）。以酒糟为原料，利用微生物发酵技术制作纤维酵解绿色产品，能显著提高粗蛋白质含量（李慧芬和马成，2017），是实现酒糟大规模资源化利用和解决环保问题的有效途径（王和玉等，2015；郭夏丽等，2014）。

酵母菌本身具有很高的营养价值，可以促进动物胃肠道的菌群平衡，改善消化能力，增强免疫力，有助于动物健康，在畜牧业生产中的应用前 景 广 泛 （Amayadelgado等，2013；Liang等，2009；Klosowski等，2006）。白酒酒糟中含有丰富的蛋白质，但营养价值不均衡，有许多动物难消化的纤维素等其他成分，所以直接饲用率极低，利用酵母菌对白酒酒糟再次发酵，可以提高酒糟的利用率及适口性。

由于酒糟本身所含的糖分在酿造白酒的过程中被大量消耗，直接使用酒糟来培养酵母菌的效果不是很理想。所以在发酵的过程中需要添加可以降解纤维素的外源菌株与酵母菌共同作用，提高饲料的利用率（郭素环等，2012；李日强等，2003）。有研究指出，同时接种酵母菌与纤维素降解菌对秸秆的降解率没有较大的提升，而分次加入两种菌进行不同步发酵，可以明显提升秸秆的降解率，软化秸秆（陈风风，2013）。焦肖飞等（2015）用混菌对发酵白酒糟的研究显示，当接种枯草芽孢杆菌和白地霉培养24 h后，再接种产朊假丝酵母培养72 h，粗蛋白质含量达32.09%。本研究首先用纤维素降解菌对纤维素类物质进行降解产生可溶性糖，然后接种酵母菌进行培养，使得酵母菌的数量可以有较大的提升。试验结果表明，当填料量为15 g、含水率为40%、温度为30℃时，接种0.6%的枯草芽孢杆菌K-2 24 h后再加入接种量为0.3%的酵母菌J-1，发酵72 h后白酒酒糟的酵母菌活菌数达到最大，粗蛋白质含量最高可达25.91%，比发酵前提高了60.43%。本研究为混菌发酵白酒酒糟制备动物蛋白饲料的深入开发提供了依据。