LncRNA PVT1 rs2114358 不同基因型在结直肠癌中的表达

过琴，方介群，周桓

（江南大学附属医院检验科，江苏 无锡 214000）

0 引言

结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是最常见的恶性肿瘤，在我国发病率逐年增加[1]。研究表明，长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用[2]。浆细胞瘤转化迁移基因1（plasmacytoma variant translocation gene 1,PVT1）已被证实与多种肿瘤的发生有关，如胃癌、卵巢癌、结直肠癌[3]，但具体作用机制尚不明确。本研究主要通过分析PVT1 上单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）在CRC 中的表达情况，以期为明确PVT1 在CRC 中的作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集江南大学附属医院在2019 年3 月至9 月手术治疗的CRC 患者28 例，术前均未接受放疗、化疗等治疗，所有病例中的组织经病理证实为结直肠癌。手术后立即进行取材并储存于-80℃冰箱保存备用。实验组为肿瘤组织，对照组为距离肿瘤组织边缘至少8cm 以上的正常肠黏膜上皮组织。组织标本均经过患者家属书面同意并取得医学伦理委员会的批准。

1.2 试剂与仪器

提取组 织RNA 中Trizol（Ambion 公 司），组 织DNA 提取试剂盒（9765）、反转录试剂盒（RR036A）、TB green（RR820A）均购自Takara 公司，所有引物均由华大基因合成。

实时荧光定量PCR 仪器为ABI 7500 型（美国ABI 公司）、Nanodrop 核酸定量分析仪（美国Thermo Fisher 公司）、PCR 基因扩增仪（美国Thermo Fisher 公司）、凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）。

1.3 基因型测定、反转录反应及实时荧光定量PCR 反应（real-time quantitative PCR）

从DNA 提取试剂盒中提取出DNA 后，进行LncRNA PVT1 rs2114358 PCR 扩 增，引物序 列如下：F（5’-3’）：GTTCACTAGCTTGCAAATAC/T；R（5’-3’）：TCTACGGATGCATCTCTCAG。PCR 扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s 共30个循环，72℃彻底延伸7min，1%琼脂糖凝胶中跑胶，凝胶成像系统拍照，产物测序。

Trizol 法提取组织RNA 后，根据反转录试剂盒及TB green 试剂盒法进行RT-qPCR 反应，引物序列如下：F(5’-3’)：GGAGATTAAAAAGATGCCCCTC；R（5’-3’）：GCGTTATTCCCCAGACCACTGA；内参基因GAPDH 引物序列如 下：F（5’-3’）：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT；R（5’-3’）：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。反转录反应条件如下：37℃ 15min、85℃ 5s。实时荧光定量PCR反应条件如下：95℃预变性2min，95℃变性5s、60℃退火34s 共40 个循环，最后增加溶解曲线。根据溶解曲线判断PCR 扩增的特异性，采用2-ΔΔCT 方法计算PVT1 的相对表达量。

1.4 统计学分析

采用GraphPad Prism 7.0 统计学软件处理研究数据，采用两组样本的t检验，P＜0.05 作为判定差异有统计学意义的依据。实验包含3 次生物学重复，每个生物学重复设置3 个复孔。

2 结果

2.1 基因型检测

LncRNA PVT1 rs2114358 基因型扩增凝胶电泳图，见图1；28 例CRC 组织中，CC 型占21.4%（6/28），CT 型占39.3%（11/28），TT 型占39.3%（11/28）。

图1 DNA 扩增产物凝胶电泳图

2.2 PVT1 SNP 在组织中的表达

在PVT1 rs2114358 的三个基因型（CC 型、CT 型、TT型）相较于配对的正常肠组织中，CT 型在肿瘤组织中高表达，最大的差异倍数为3.97 倍（*P＜0.05）；CC 型在肿瘤组织中低表达。见图2。

图2 PVT1 rs2114358 不同基因型在CRC 肿瘤组织中相较于正常组织中表达的差异倍数

3 讨论

LncRNA 是一类长度超过200bp，生物来源广泛、结构保守的RNA 分 子[4]。Zhu 等[5]测 序发现，膀胱癌中3324 个lncRNAs 差异表 达，2120 个lncRNAs 差异倍 数超过2 倍。Huang 等[6]发现，OECC 在CRC 组织中高表达，且与肝转移呈正相关。BCYRN1、kcna3 在CRC 组织中高表达[7,8]，BANCR 在CRC 组织中低表达[9]。研究表明，lncRNA 可作为预测肺癌、结直肠癌、乳腺癌和卵巢癌的预后指标[10]。基因遗传变异对基因的结构及功能产生较大影响，进而影响生物学功能。SNP 是最常见的遗传变异，由单个核苷酸的改变（包括转换、颠换、缺失和插入）引起的基因多态性[11]。Mao 等[12]在晚期CRC 患者中发现，rs744591 和rs745666 与卡培他滨化疗疗效相关；rs744591 位点为A/A 纯合子时，化疗效果显著差于其他基因型；rs745666 为G/G 时，则化疗效果显著优于其他基因型。PVT1 不同基因型在CRC 组织中表达量不同，可以丰富PVT1 在CRC 中的作用机制。但具体的药物治疗疗效还有待进一步的研究。