不同处理的蚯蚓产物对猪场源有害菌抑菌效果的对比研究

田佳敏，莫奕豪，杨悦妍，金翔，代宇星，张建斌，贾京华，蒲蕾,通信作者，郭亮,通信作者

不同处理的蚯蚓产物对猪场源有害菌抑菌效果的对比研究

田佳敏1，莫奕豪1，杨悦妍1，金翔1，代宇星1，张建斌1，贾京华2，蒲蕾1,通信作者，郭亮1,通信作者

（1. 天津农学院 动物科学与动物医学学院 天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 300392；2. 天津民生生物工程股份有限公司，天津 301500）

为研究蚯蚓的不同处理对几种猪场常见有害菌的抑菌性能，从而将其运用到猪的饲料添加剂中。本试验利用纸片扩散法和紫外分光光度法对比研究蚯蚓匀浆液、电击蚯蚓获得的体腔液、诱导后电击蚯蚓所得的体腔液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和猪链球菌的抑菌性能。通过纸片扩散法研究发现只有蚯蚓匀浆2∶1组对大肠杆菌有抑菌效果；蚯蚓匀浆2∶1组、4∶5组，蚯蚓电击处理和诱导电击处理均对金黄色葡萄球菌有抑菌效果；只有蚯蚓匀浆4∶5组对猪链球菌有抑菌效果。通过分光光度对比发现，蚯蚓匀浆组和电击处理组均无明显的抑制效果；蚯蚓电击处理组可以显著抑制葡萄球菌的增长（＜0.05），而蚯蚓匀浆组抑制效果不明显；蚯蚓匀浆组和电击处理组对猪链球菌无明显抑制效果，甚至蚯蚓匀浆组在6 h时值与对照组有显著上升。本文研究了蚯蚓不同处理对猪场有害菌的抑菌性能，为研发无抗和替抗饲料提供了依据。

大平二号蚯蚓；匀浆上清液；电击上清液；诱导电击上清液；猪场有害菌；抗菌性能

蚯蚓（Earthworm，中医称地龙）具有清热定惊、通经、平喘、利尿等作用，较广泛地用于中医中药，在多种疾病治疗上有着较好的疗效[1]。在长期进化过程中，为了适应不利的生存环境，蚯蚓体内必然有独特的抗菌与免疫系统[2]。正常情况下，蚯蚓在受到机械、化学、电、热等刺激后，可分泌出黄色的体腔液，该体腔液含有多种抗菌肽类物质[3]。刘文群等通过超声波诱导从蚯蚓体内得到抗菌肽类成分[4]。综上所述，蚯蚓提取物对细菌有抑菌效果，但有菌株差异性。由于在制备蚯蚓提取液过程中存在提取率低等问题（提取率一般在5%以下）[5]，比较不同处理对蚯蚓抑菌效果的研究具有重要意义。本研究主要采用纸片扩散法和分光光度法测蚯蚓匀浆液、电击蚯蚓获得的体腔液、诱导后电击蚯蚓所得的体腔液的抑菌效果，从而探究蚯蚓不同处理对几种猪场常见有害菌的抑菌性能，为以后蚯蚓资源开发利用提供依据。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 蚯蚓与菌株

牛粪基料中饲养的大平二号蚯蚓、大肠杆菌（）；金黄色葡萄球菌（）；猪链球菌（）。

1.1.2 试剂与药品

LB营养琼脂、胰蛋白胨大豆琼脂、LB肉汤培养基、药敏片、PBS缓冲液、无菌水。

1.1.3 试验仪器

DSX-280B型高压蒸汽灭菌锅、AX224ZH型电子天平、GZX-9240ME型鼓风干燥箱、热空气消毒箱、恒温培养箱、HZQ-F100型振荡培养箱、TGL-16B型高速台式离心机、SW-CJ-2F型超净工作台、TP-24型Tissue Prep快速组织细胞破碎仪、UV-5100B型紫外可见分光光度计。

1.2 纸片扩散法试验方法

1.2.1 蚯蚓体腔液提取和处理

取活性高的蚯蚓，冲洗，排粪10 h，多次用无菌水冲洗后用PBS缓冲液再冲洗，用滤纸吸除水分，备用。取30 g蚯蚓和300 μL PBS（保持体腔液的酸碱平衡）均等分为3份，用于匀浆、电击及诱导电击。匀浆时，将蚯蚓装于离心管中并放入一药匙研磨珠，按不同比例加入蒸馏水稀释，蚯蚓与蒸馏水的稀释比例由浓到稀依次2∶1和4∶5。作好标记，放入快速组织细胞破碎仪，匀浆；电击时，用自制的5 V电压电击蚯蚓15 min，将蚯蚓分泌出的黄色体腔液用移液器收集于离心管中，作好标记[6-8]；诱导电击时，取100 μL大肠杆菌菌液将蚯蚓浸泡其中，3 h后用自制的5 V电压电击蚯蚓15 min，将蚯蚓分泌出黄色体腔液用移液器收集于离心管中，作好标记[9]。将处理好的蚯蚓提取物放入离心机，4 000 r/min离心20 min，收集上清液，备用。

1.2.2 药敏片的制备

先将滤纸片放入高压灭菌锅30 min，再放入60 ℃烘箱中烘干备用。无菌操作，将滤纸片放入制备好的液体离心管中，放入振荡培养箱中，160 r/min、2 h使其充分浸泡，将离心管取出放置于超净工作台。用镊子将药敏片平贴于空培养皿中，作好标记，放入37 ℃恒温培养箱，12～24 h使其烘干[10-11]。

1.2.3 抑菌圈测定

采用纸片扩散法（K-B法）[12-14]进行抑菌效果测定。将制作好的药敏片紧贴于待测菌种所在培养基上，不同种药敏片之间要保留一定距离，避免互相干扰。然后将贴好药敏片的平板倒置于37 ℃培养箱内培养24 h，并分别在培养的第6、12、24小时使用游标卡尺测量其抑菌圈直径大小，测量3次取平均值。直径大则抑菌作用强，直径小则抑菌作用弱。

1.3 分光光度计试验方法

将10 g大平二号蚯蚓按上述方法制作匀浆上清液和电击上清液备用，蚯蚓匀浆液为蚯蚓与水的比例为1∶4，电击上清液使用原液。取活化好的0.5 mL菌液加入到20 mL液体培养基中，移至试管，再加入0.82 μL匀浆上清液和电击上清液，摇匀，放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h。分别在培养的第0、6、12、24小时利用紫外可见分光光度计测其值[15]，测前要将紫外分光光度计预热20 min，菌液摇匀，吸光度调至540 nm，测量3次，取平均值±标准差，得到差值用SPSS软件进行方差分析，进行差异显著性检验[16-17]。

2 试验结果

2.1 纸片扩散法抑菌圈试验结果

在4种处理对大肠杆菌的抑菌圈试验中，蚯蚓∶蒸馏水＝2∶1组，6、12、24 h的抑菌圈分别为10.630±0.140、10.110±0.160、9.320±0.140 mm，且随着时间增长，抑菌圈有减小的趋势。蚯蚓∶蒸馏水＝4∶5组，电击处理组和大肠杆菌诱导电击组对大肠杆菌无抑菌圈出现。

在4种处理对金黄色葡萄球菌的抑菌圈试验中，结果见下表1，蚯蚓∶蒸馏水＝2∶1组对金黄色葡萄球菌6 h有抑菌效果，到12 h后抑菌圈消失。蚯蚓∶蒸馏水＝4∶5组在12 h和24 h对金黄色葡萄球菌有抑菌圈出现。电击处理组在6、12、24 h对金黄色葡萄球菌有抑菌圈，且随着时间增长，抑菌圈有增大的趋势。大肠杆菌诱导电击组，在6、12 h对金黄色葡萄球菌有抑菌圈，且随着时间增长，抑菌圈有增大趋势，24 h抑菌圈消失。

表1 蚯蚓不同处理对金黄色葡萄球菌的抑菌效果研究 mm

在4种处理对猪链球菌的抑菌圈试验中，蚯蚓∶蒸馏水＝4∶5组，在6 h时对猪链球菌有抑菌圈出现为11.860±0.220，12和24 h无抑菌圈出现。蚯蚓∶蒸馏水＝2∶1组、电击处理组和诱导电击组均未发现抑菌圈。

2.2 分光光度计试验结果

分光光度对比试验发现结果见表2。蚯蚓匀浆组和蚯蚓电击组均在6、12、24 h对大肠杆菌无明显的抑菌效果。

表2 蚯蚓电击处理对大肠杆菌OD值的影响

分光光度对比试验结果见表3。蚯蚓匀浆组对猪场源金黄色葡萄球菌无明显抑制效果。蚯蚓电击组对金黄色葡萄球菌有显著抑菌效果（＜0.05）。对比发现电击组的抑菌效果较好。

表3 蚯蚓电击处理对金黄色葡萄球菌OD值的影响

注：肩标a、b、c是指各处理比较差异显著（＜0.05）。无字母或字母相同代表各处理间差异不显著（＞0.05），下同

分光光度对比试验结果见表4。在6 h时蚯蚓匀浆组对猪场源链球菌有显著抑菌效果（＜0.05）。蚯蚓电击组对猪链球菌无显著抑菌效果。对比发现匀浆组的抑菌效果较好。

表4 蚯蚓电击处理对猪链球菌OD值的影响

3 讨论

非洲猪瘟的侵袭，对我国养猪行业产生了前所未有的打击，也对猪的免疫能力提出了更高的要求。加之，无抗生素饲料时代的到来使无抗饲料研发成为了目前研究的热点。胡成等人已从饲料因素出发研究其对非洲猪瘟病毒防控的作用[18]。蚯蚓提取物因具有一定的抗菌性能、丰富的营养物质和多种治疗功效，可以作为无抗饲料研发的原料。本研究发现蚯蚓匀浆液对大肠杆菌具有抑菌效果，而电击蚯蚓获得的体腔液、诱导后电击蚯蚓获取的体腔液均对大肠杆菌无抑菌效果。而王庆华等报道经机械刺激和热刺激所得的蚯蚓提取物对大肠杆菌有显著的抑菌效果[19]。这可能是由不同处理方式获取的抗菌肽效果不同所致。本试验也发现，蚯蚓匀浆液、电击蚯蚓获得的体腔液、诱导后电击蚯蚓获得的体腔液均对金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌效果。樊慧杰在实验中提出无论有无细菌诱导，蚯蚓体腔液都对金葡萄球菌的抑制作用最大，对大肠杆菌抑制作用较差[2]。张显忠等研究发现，对蚯蚓内、外分泌液最敏感的菌种均为金黄色葡萄球菌，大肠埃希氏菌第三[20]。樊慧杰和张显忠的研究结果和本试验结果相似，可能是因为蚯蚓体内含有抑制大肠杆菌和微球菌的抗菌蛋白（MP II）。DHAINAUT等[21]和张阳等[22]也发现蚯蚓体内具有抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌蛋白。蚯蚓相关产物与猪链球菌的研究目前鲜有报道。故本研究进行了蚯蚓匀浆液和电击产物对猪链球菌的抑菌效果研究。本研究发现蚯蚓匀浆液对猪链球菌有微小的抑菌效果，电击蚯蚓获得的体腔液、诱导后电击处理的蚯蚓体腔液均对猪链球菌无抑菌效果。本试验填补了这方面的空白。猪场源有害菌的抑菌效果研究，目前还较少。故只能与其他物种来源的有害菌抗菌性能进行对比，因此研究结果间有一定差异。蚯蚓作为非常规的饲料资源，目前在猪饲料中利用还相对较少，通过本研究可以为蚯蚓相关产物在猪饲料中利用提供一定的理论依据。

4 结论

本试验应用纸片扩散法和紫外分光光度计法测量蚯蚓匀浆液、电击蚯蚓获得的体腔液、诱导后电击蚯蚓所得的体腔液对几种猪场常见有害菌的抑菌效果。蚯蚓匀浆液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和猪链球菌均有抑制效果；蚯蚓电击体腔液对金黄色葡萄球菌有抑制效果，且随着时间延长，抑菌效果呈增长或降低趋势。

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A comparative study on the bacteriostatic effects of earthworm products with different treatments on harmful bacteria from pig farms

Tian Jiamin1, Mo Yihao1, Yang Yueyan1, Jin Xiang1, Dai Yuxing1, Zhang Jianbin1, Jia Jinghua2, Pu Lei1,Corresponding Author, Guo Liang1,Corresponding Author

（1.Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China; 2. Tianjin Minsheng Bioengineering Co., Ltd., Tianjin 301500, China）

In order to study the antibacterial effect of different treatments of earthworm on several kinds of harmful bacteria in pig farm, it was applied to the feed additive of pig. In this experiment, with the paper diffusion method and ultraviolet spectrophotometry, the body cavity fluid obtained by electric shock of earthworm, and the body cavity fluid obtained by electric shock of earthworm after induction were compared to analyze the bacteriostatic performance on escherichia coli, staphylococcus aureus and streptococcus suis. Through the paper diffusion method, it was found that only earthworm homogenate group 2∶1 had bacteriostatic effect on escherichia coli. Earthworm homogenate in groups 2∶1 and 4∶5, earthworm electroshock treatment group and induced shock treatment group all had antibacterial effects on staphylococcus aureus. Only earthworm homogenate group 4∶5 had antibacterial effects on streptococcus suis. By spectrophotometric comparison, it was found that earthworm homogenate and the electroshock treatment group had no significant inhibitory effect. Earthworm electroshock treatment group could significantly inhibit the growth of staphylococcus (<0.005), while earthworm homogenate group had no significant inhibitory effect. Earthworm homogenate and the electroshock treatment group had no obvious inhibitory effect on streptococcus suis from big farm, and even thevalue increased significantly at 6 h. The research on the antibacterial properties of earthworm on harmful bacteria in pig farms provides the basis for the study of non-resistant and substitute resistant feed.

daping no.2 earthworm; homograte supermatan; supernatant of electric shock; induced shock supernatant; pig farms harmful baceria; antibacterial properies

Q93

A

1008-5394（2021）02-0043-04

10.19640/j.cnki.jtau.2021.02.009

2019-10-21

青海省重点研发与转化计划—科技援青合作专项（2021-QY-204）；天津农学院大创项目（201810061234）；天津生猪产业技术体系创新团队（ITTPRS2021006）；天津市种业专项（15ZXZYNC00100）

田佳敏（1997—），女，本科在读，主要从事猪遗传育种方面的研究。E-mail：1554592683@qq.com。

蒲蕾（1987—），女，讲师，博士，主要从事猪遗传育种方面的研究。E-mail：pulei87@126.com。

郭亮（1964—），女，教授，硕士，主要从事养猪生产方面的研究。E-mail：liangguo177@vip.sina.com。

责任编辑：张爱婷