鸡胚模型在生物学研究中的应用进展

袁若男，于晓雪,通信作者，李秀荣，李留安，潘鹏宇，孟玉芳，向军，祁海臻，杜楠

鸡胚模型在生物学研究中的应用进展

袁若男1，于晓雪1,通信作者，李秀荣2，李留安1，潘鹏宇1，孟玉芳1，向军1，祁海臻1，杜楠1

（1. 天津农学院 动物科学与动物医学学院 天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 300392；2. 巴彦淖尔市临河区农畜产品质量安全中心，内蒙古自治区 巴彦淖尔 015000）

鸡胚离开母体独立发育，便于获得大量相同发育时期的胚胎进行批量操作，且在胚胎期操作对母体不造成伤害，是应用广泛的重要动物模型。通过查阅大量文献，本文对鸡胚模型在疾病模型、病毒学研究、寄生虫学研究、药物作用研究及生长发育等生物学研究领域的应用现状进行了总结阐述，以期为继续拓展鸡胚模型的应用前景提供参考。

鸡胚模型；可视化孵化；生物学研究

鸡胚独立于母体发育，在种蛋产出后进入短暂休眠，并在条件适宜时继续发育，且较其他动物胚胎模型而言容易获得。这些特点使鸡胚成为重要的动物模型，科研工作者可控制孵化条件将大量鸡胚处于相同发育时期，从而进行批量操作，且对鸡胚的操作避免了对母体的伤害。本文总结了鸡胚模型在疾病研究、药物作用等生物学研究领域中的应用现状，为拓展鸡胚在生物学中的研究和应用提供参考。

1 鸡胚动物模型在生物学领域的应用

1.1 鸡胚在血管生成与抗血管生成研究中的应用

鸡胚绒毛尿囊膜（Chick chorioallantoic membrane，CAM）是广泛应用于研究血管形成和抗血管形成的理想体内模型。郭振亚等通过7日龄鸡胚开窗，将灭菌定性滤纸圆片放入CAM血管较少部位，并滴加索拉非尼和沙利度胺的稀释液及混合液，无菌封口后继续孵化2天，结果显示索拉非尼和沙利度胺均有良好的抗血管生成作用，且联合用药抗血管作用更加显著[1]。崔杰等人通过相同的方式在鸡胚孵育7日龄开窗，将银杏叶提取物加入放置鸡胚CAM中的灭菌圆片中，封口后继续孵化2天，观察到血管数量增多且血管颜色加深，证明银杏叶提取物能够促进血管新生[2]。除此之外，钩吻总碱[3]和绿茶多酚[4]等对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成具有抑制作用；淫羊藿苷[5]和芪参益气滴丸[6]等对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成具有促进作用，其作用效果与剂量一般成量效关系。

1.2 鸡胚在癌转移与抗癌药物研究中的应用

癌症转移是全球癌症死亡的主要原因，通过鸡胚模型了解癌症转移的机制，并筛选各种治疗药物是癌症生物学和药物研究新的领域。研究发现，将人癌细胞系接种到CAM上，其移植瘤组织结构与人癌组织结构类似[7]。将过表达绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）的癌细胞注射至鸡胚血管中，可检测GFP标记癌细胞的迁移以及迁移过程中器官的变化[8]。抗癌药物的作用机理通常是通过靶向抑制癌细胞中的血管生成来实现的。余猛等利用反向寻靶法发现沙苑子苷A能调控原癌基因络氨酸蛋白激酶和肿瘤血管生成的相关靶点蛋白，利用分子对接法发现其能与肿瘤血管生成的相关靶点结合，表明沙苑子苷A能调控肿瘤基因的表达并能抑制血管生成从而发挥抗肿瘤的作用[9]。肝素硅阿霉素抗癌药物系统对碱性成纤维生长因子诱导血管生成和正常新生血管均有一定抑制作用[10]；丙戊酸钠具有阻断肿瘤生长、侵袭和血管生成的作用[11]；龙葵碱和血管内皮生长因子抗体两者联合使用可更加有效抑制人结肠癌HT-29细胞系诱导的肿瘤血管生成及肿瘤增 殖[12]。

1.3 鸡胚在寄生虫研究的应用

鸡胚模型在寄生虫研究中也有所应用，主要是艾美耳球虫与贝氏隐孢子虫。鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于鸡肠道所引起的一种危害严重的寄生虫病，鸡柔嫩艾美耳球虫的分泌物及代谢产物可使鸡胚原代盲肠上皮细胞的活性显著下 降[13]。研究者们对防治鸡球虫病从药物防治逐渐转移到免疫防治，制备鸡胚传代致弱球虫苗，球虫孢子在鸡胚尿囊膜上连续生长几代后其致病力减弱但其免疫原性不变[14]。贝氏隐孢子虫广泛存在于多种脊椎动物体内，是引起主要临床表现为腹泻的人畜共患病的原虫，鸡胚能充当贝氏隐孢子虫的自然宿主细胞并支持和发展贝氏隐孢子虫的内生生命周期[15]。研究表明，制备大量贝氏隐孢子虫囊胚可采用9日龄鸡胚尿囊膜接种法，实时荧光定量PCR方法能快速、特异的定量检测贝氏隐孢子虫在鸡胚中良好的S型扩增曲线[16]。复方磺胺对甲氧嘧啶以一定剂量连续使用一定时间对雏鸡贝氏隐孢子虫病有潜在治疗作用[17]。

1.4 鸡胚在病毒研究中的应用

鸡胚在病毒致病机理和疫苗制备及效价检测方面有广泛应用。感染塞卡病毒的鸡胚表现出更高的缺陷发生率，如发育中脑量减少、面部异常等中脑缺陷[18]；通过鸡胚免疫方法接种新城疫分离毒株，可检测到雏鸡有较高的抗体水平，因此可用此方法防控养殖场发生新城疫[19]；鹅源禽痘病毒可在鸡胚中增殖，五轮传代后鸡胚病变及病毒滴度趋于稳定[20]；经鸡胚传代培养的鸭甲型肝炎病毒减毒活疫苗可为雏鸭提供有效免疫保护[21]；将四价流感病毒接种于健康鸡胚尿囊腔中，48～72 h后获取尿囊液，制取四价流感亚单位疫苗[22]；原代鸡胚成纤维细胞可用于冻干人用狂犬疫苗生产[23]。

1.5 鸡胚在中枢神经系统发育研究中的应用

各种化学和物理因素对鸡胚的中枢神经发育会造成不同程度的影响。神经管缺陷是胚胎发育过程中发生的严重的中枢神经系统先天缺陷，高剂量的双氯芬酸钠或苯丙氨酸氨基酚可导致早期鸡胚中线闭合缺陷，并导致大脑和脊柱畸形，甚至导致鸡胚死亡或终身残疾[24-25]。小脑发育易受糖皮质激素的影响，鸡胚胎期过多的糖皮质激素刺激可引起小脑功能障碍与神经发育障碍[26]。染料木黄酮注射入鸡胚的卵黄囊中可能会影响神经上皮细胞发育，从而影响整个神经系统发育过程[27]。藻红蛋白是一种红色染料，使用允许剂量的一半可增加早期鸡胚胎神经管缺陷的风险[28]。不同浓度的硒通过调控硒磷酸酯合成酶Ⅰ影响鸡胚中枢神经系统发育，高浓度的硒对神经元有毒性作 用[29]。与未暴露于磁场的胚胎相比，暴露于磁场的胚胎神经导管闭合缺陷显著增加[30]。

1.6 鸡胚在心血管系统发育研究中的应用

利用独立于母体发育的鸡胚作为试验动物，来研究氧气、营养或应激激素等的变化对心血管系统发育的影响，可以排除母体或胎盘的生理变化影响[31]。心血管系统是机体发育过程中最易缺氧的系统之一，在急性和慢性缺氧条件下孵化会导致胚胎出现多种结构和功能上的心脏缺陷[32]。发育中的胚胎对氧化应激非常敏感，而氧化应激是导致妊娠相关疾病的一个重要因素，2，2’-偶氮二异丁基脒二盐酸盐诱导的氧化应激可导致鸡胚心血管系统损伤[33]。浓度为5～20 μg/mL蟛蜞菊醇提物能够极显著提高心肌细胞活性，可以有效减缓热应激对原代鸡胚心肌细胞损伤[34]。用治疗剂量的氟苯尼考注射母鸡后产卵并孵育，鸡胚血管密度降低，包括血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子在内的与血管生成相关的关键基因在卵黄囊膜中的表达水平也降低[35]。

1.7 鸡胚在个体生长发育研究中的应用

在鸡胚孵化过程中理化因素改变或加入某些外源物质，可能影响其生长发育和生产性能。磁共振成像会导致胚胎发育迟缓[30]；氟苯尼考会抑制鸡胚发育[35]；类固醇可能会影响胚胎生长而不影响大脑分化[36]。在鸡胚发育过程中，控制脂肪沉积的关键因素是脂肪酸降解，因此鸡胚是用于研究人类肥胖症的良好动物模型[37]。将11日龄鸡胚小肠结扎，近端肌肠神经节数目增加且肌肠神经节向更小的方向移动[38]。胚胎第4天是性腺分化的初始阶段，在此时注射双酚A代谢物并用石蜡封口，孵育至19日龄可观察到雌性表现出更小的左侧卵巢，而雄性表现出更小的睾丸，表明双酚A代谢物扰乱了雄性和雌性生殖器官发育[39]。

1.8 鸡胚在嵌合体动物或转基因鸡研究中的应用

嵌合体动物是由来自多个受精卵的体细胞或生殖系组织组成的个体，种间嵌合体的组织来源于不同的物种。鸡胚模型在制备嵌合体动物来保存濒危鸟类或其他物种基因的研究中，已被证明是非常有用的工具。有研究显示，通过种内移植的方法对鸡迷走神经细胞进行永久性GFP标记，迷走神经细胞从后脑进入前肠，再从后肠沿着胃肠道形成肠神经系统，获得表达GFP的转基因鸡胚，将含有GFP阳性神经嵴细胞的肠段移植到受体胚胎的迷走神经区域，阳性GFP重新向肠和肺的方向迁移同时定植于肠道和肺[40]。利用转基因手段制备转基因鸡，可进行基因功能研究或培育优势鸡品种，其中逆转录病毒载体介导法是应用较广泛和成功率较高的方法，慢病毒的应用使这种方法更加有效、安全[41]。慢病毒载体携带大型转基因，并有效地感染和整合这些基因到分裂细胞和非分裂细胞的基因组中，成为将遗传物质运输到细胞和组织的理想载体[42]。王爽等利用慢病毒包装抗高致病性禽流感病毒基因，显微注射鸡胚血管来制备转基因鸡，慢病毒颗粒在胚胎外周血管中感染经血液循环的原始生殖细胞（Primordial germ cells，PGCs），抗病毒基因整合到PGCs中，完成制备转基因鸡[43]。JIANG等利用修饰的Sindbus病毒包膜蛋白偶联抗PGC膜蛋白特异性抗体制成慢病毒载体，提高了目的基因靶向传导效率，增加外源基因的嵌合率[44]。笔者实验室发现，采集鸡胚血液中PGCs，微注射入鸭胚中，可在鸭胚多个器官中检测到嵌合现象，如肝脏、脑、性腺，证明了异种之间注射PGCs制备种间嵌合体具有很大潜力。另外，将稳定表达GFP的DT40细胞微注射于鸡胚血管中，可在出雏鸡多个组织中检测到外源蛋白表达，说明可以利用鸡胚作为生物反应器的动物模型。

2 小结与展望

与其他动物模型相比，鸡胚具有价廉、容易获得、脱离母体便于实时观察以及敏感性强等优点。因其生理优势，鸡胚模型在血管生成、癌症转移与治疗、寄生虫和病毒研究、各系统发育和个体发育以及嵌合体动物和转基因动物研究中普遍应用，且具有独特的优越性，甚至在生物学的生产实践中也优势明显，如制备转基因鸡作为生物反应器来生产药用蛋白等。

受孵化规模小、自然光照较少、温室缺乏等条件限制，实验室内的种蛋孵化率和雏鸡存活率较规范化鸡场低，可促进科学研究与产业化的有机结合，发挥优势互补，提高实验室鸡胚的孵化率和存活率，同时加速科研成果转化。相信在科研工作者的共同努力下，随着孵化条件控制越来越精准和可视化孵化不断发展，鸡胚模型在生物学领域的应用将越来越广泛。

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Chicken embryo and application in biological research

Yuan Ruonan1, Yu Xiaoxue1, Corresponding Author, Li Xiurong2, Li Liuan1, Pan Pengyu1, Meng Yufang1, Xiang Jun1，Qi Haizhen1, Du Nan1

（1. Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry, College of Animal Science and veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China; 2. Agricultural and Animal Product Quality and Safety Center of Linhe district, Bayannaoer 015000, Inner Mongolia Autonomous Region, China）

Chicken embryos develop independently from the mother body. It is convenient to obtain a large number of embryos in the same development period to carry out batch operations, and the operation during embryo stage does not harm the mother body. Therefore, chicken embryo has been an important experimental animal model which was widely used. This paper summarized the current application of chicken embryo models in biological studies such as diseases and drug effects, with the purpose to provide reference for expanding the application prospects of chicken embryo models.

chicken embryo model; hatching; biological research

S831.3

A

1008-5394（2021）02-0094-04

10.19640/j.cnki.jtau.2021.02.019

2020-05-07

天津农学院大学生创新训练项目（201803015）；国家自然科学基金项目（3170223）；天津市“131”创新型人才团队项目（JRC2018044）；天津市企业科技特派员项目（19JCTPJC59500）；天津市科技重大专项与工程项目（18ZXBFNC00310）

袁若男（1997—），女，本科在读，主要从事畜禽兽医学研究工作。E-mail：1055990579@qq.com。

于晓雪（1990—），女，讲师，博士，主要从事畜禽兽医学研究工作。E-mail：yuxiaoxue1990@163.com。

责任编辑：张爱婷