生物基质中雌激素的液相色谱-串联质谱定量分析方法研究进展

范茹婷， 肖华明， 察冬梅， 王 献

(中南民族大学化学与材料科学学院，分析化学国家民委重点实验室，湖北武汉 430074)

1 前言

在生物基质中总雌激素被定义为母体雌激素及其代谢产物的总和。母体雌激素包括雌酮和雌二醇，总代谢物是母体雌激素在2-，4-和16-途径的代谢物的总和[1,2]。Xu等[3]对这些代谢物的代谢途径进行了研究。人体内雌激素的浓度水平与机体功能和疾病有着密切的关系。当雌激素的代谢趋向于因氧化而变得不平衡时，就会形成大量的加合物，大大增加患癌症的风险[4]，可能引起的疾病有肝癌(肝纤维化)[5]、先兆子痫[1]、乳腺癌[6,7]等。在疾病的诊断和预防以及癌症流行病学研究中，需要一种高度灵和高特异性的方法来确定雌激素的含量。目前雌激素的检测涵盖不同类型的生物样本，如血液、尿液、乳腺癌细胞[8]、前列腺[9]、皮肤[10]、和乳房，以及肾上腺、睾丸、肝脏、卵巢和子宫等等[11,12]。为了研究人类生殖发育和疾病中雌激素的生物效应，还会以小鼠、猴子为模型[1]来研究雌激素的代谢途径。

生物组织和体液中的雌激素浓度通常较低，且浓度范围跨度大[13]。青春期前的儿童、青少年，绝经前和绝经后妇女以及孕妇体内的雌二醇浓度范围的跨度高达两个数量级。因此，在如此宽的浓度范围内对雌激素进行准确定量是一项困难的工作[14]。此外，同分异构体的存在(如雌激素的代谢物17α-雌二醇和17β-雌二醇)，使得雌激素检测更加困难[15,16]。目前，生物样本雌激素定量检测的的主要方法有酶联免疫吸附法(ELISA)[17 - 19]、放射免疫法(RIA)[20 - 22]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[23]及液相色谱-质谱法(LC-MS)[24]。RIA和ELISA法等免疫测定已在临床和环境实验室中广泛使用[25]。但是RIA法中的放射性元素需要严格控制，并且需要繁琐耗时的操作过程[26]。ELISA法选择性差，易与其他雌激素或试剂盒试剂发生交叉反应[27]。GC-MS法检测时间较长，且热稳定性差的化合物容易发生复杂的源内裂解，不利于GC-MS的精确定量[23]。液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)能够实现高通量快速检测，且假阳性率低，适用于生物基质中痕量类固醇化合物的分析，成为目前的主要检测方法之一[24]。

雌激素的生物学功能研究及其代谢过程与疾病相关性信息的获取，需要开发出对雌激素精确定量的分析方法。本文针对LC-MS/MS联用技术检测不同生物基质中雌激素的研究进展，对样品前处理、衍生化方法、色谱-质谱的仪器与方法，以及不同类型的生物基质中雌激素的检测结果进行了综述和讨论，并对雌激素检测领域未来需要解决的问题进行了展望。

2 前处理方式

提取不同生物基质中的雌激素，最常用的方法是液-液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)。雌激素分析流程如图1所示，主要包括样品的提取、衍生化及LC-MS/MS检测三部分。

图1 雌激素LC-MS/MS分析流程图Fig.1 Flow chart of the LC-MS/MS analysis of estrogens

2.1 液-液萃取

LIE技术采用两种极性不同并且互不相溶的溶剂来提取亲脂性分析物，然后可以对其进行有效干燥并重构，以注入到LC-MS/MS系统中进行检测。LLE在蛋白质沉淀方面也提供了重大改进，可去除脂质部分(包括磷脂)[27]。已有报道用乙酸乙酯[28]、甲基叔丁基醚(Methyltert-Butyl Ether,MTBE)[29,30]、氯丁烷[31]等有机溶剂从生物基质中提取雌激素。在使用化学衍生化方法时，通常使用LLE进行雌激素提取，通过优化比较不同的提取溶剂发现使用乙酸乙酯回收率更高。而使用MTBE时，会出现更高的基质效应[28]。但是LLE需要使用大量有机溶剂，对人体健康和环境都会造成不利的影响[32]。

2.2 固相萃取

SPE与LC-MS/MS结合使用对于半自动化样品分析是一种非常有前景的技术。在线SPE的优势包括分析时间更短、浓缩富集增敏和减少样本污染等，使得方法的灵敏度进一步提高[33]。离线的SPE小柱通常涉及一系列固定相材料，且临床应用中都是可商用的C18反相柱或离子交换柱。Han等[34]计算了六种雌激素的logKOW范围为2.94～4.52,疏水性中等，因此使用硅胶作为填料进行分散固相萃取时，能够比C18小柱更好地将中等极性的雌激素成分进行保留。亲脂-亲水Oasis©HLB吸附相，对于类固醇类化合物具有极好的保留效果[35]。Zhao等[36]报道了一种仅使用一个SPE步骤测定尿液中游离雌激素的方法，该方法将样品加载到Oasis HLB©(亲水-亲脂)柱上后，用乙酸乙酯洗脱游离的雌激素。Liu等[37]利用PRiME HLB固相萃取小柱可以有效地将牛乳和乳粉中的脂肪等干扰成分去除，在牛乳基质中的加标回收在87.7%～110.8%以内。对于血清、血浆等复杂基质，使用市售Oasis MCX©离子交换柱，通过阳离子交换作用可在洗脱雌激素之前，将血浆中的离子抑制作用降至最低，从而有效去除血浆样品中的磷脂使样品得到净化[38]。Beinhauer等[39]通过将带电本体衍生化和基于弱阳离子交换(WCX)RAM捕集柱相结合，进行自动在线捕集和洗脱样品，简化的流程仅需100 μL血清，定量限可以达到3 pg/mL，适用于雌激素含量较低的人群，如年长的男性、儿童和绝经后的女性。磁性固相萃取(MSPE)技术也开始应用于检测生物基质中的雌激素。Xiong等[40]开发了一种MSPE方法，采用具有双十八烷基和2-氨基乙基-3-氨基丙基(C18/NH2-Fe3O4@mSiO2)官能团的磁性介孔SiO2核-壳纳米粒子，合成磁性纳米颗粒作为MSPE的吸附剂。与传统的SPE相比，其MSPE操作更简单，不需要特殊的仪器以及复杂的表面修饰。该方法应用于检测市售猪里脊肉和鸡胸肉样品中的十一种雌激素，检出限为0.02±3.00 μg·kg-1。在复杂食品样品中的痕量化合物进行分析具有良好的可行性和前景。

3 化学衍生-LC-MS与直接LC-MS雌激素检测方法对比

3.1 化学衍生与LC-MS联用法

化学衍生化是一种常见的样品前处理手段，通过与衍生试剂的反应来修饰分析物上的官能团，以增强分析物的紫外[41]、荧光[42]或质谱响应[43]。在LC-MS分析中，衍生试剂可以通过改变目标化合物的活性基团，例如胺基、羧基、羟基、硫醇基等来改变目标化合物的色谱保留时间[44]。此外，还可以提高改性分析物的电离效率，从而有效提高其检测灵敏度。类固醇雌激素和酚类异雌激素属于弱酸，与其他极性较大的化学药品相比，它们在电喷雾电离-质谱(ESI-MS)和大气压化学电离-质谱(APCI-MS)上的电离效率不高[45]。通过化学衍生可以在类固醇雌激素和酚类异雌激素上增加部分亲脂性基团，从而提高电离效率，并增强质谱响应信号[46,47]。

丹磺酰氯(Dansyl Chloride,DNS)是使用率最高的衍生化试剂之一，常用于雌激素的衍生[28,48 - 50]。该试剂可以与酚羟基和氨基官能团靶向结合，使化合物可用于荧光、紫外和质谱分析检测[51,52]。由于该试剂的二甲氨基基团具有强质子亲和力，丹磺酰氯的衍生物表现出良好的质谱响应信号。丹磺酰氯的质谱增敏作用可辅助发现并定量人体内潜在的雌激素代谢产物[53]。Van等[54]利用丹磺酰氯衍生一次性检测出27种雌激素的代谢产物。丹磺酰氯与酚羟基的特异性反应，还可以平行测定人体内多种类固醇激素，实现针对一种疾病的类固醇代谢通路的高通量检测[55]。尽管采用丹磺酰氯和吡啶-3-磺酰氯(Pyridine-3-sulfonyl Chloride,PS)进行酚羟基的衍生化都是基于亲核取代反应，但是吡啶-3-磺酰氯中的吡啶基团的有着较小尺寸，而小位阻的单-PS衍生物会增加双酚的第二羟基部分的衍生化速率。引入带碱性N的PS官能团可将分子预测的pKa增加至2.5左右，从而促进化合物在水溶液中的电离[56]，1-甲基咪唑-2-磺酰氯(1-Methylimidazole-2-sulfonyl Chloride,IS)[43]与丹磺酰氯反应原理相类似，但是咪唑磺酰基比丹磺酰基部分小且亲脂性较低，因此所有IS衍生产物的分析时间短并且所需的溶剂更少。Li等[30]检测时使用orbitrap MS对精确质量的母离子进行定量，因此无需再处理碎片离子，使用1,2-二甲基咪唑-5-磺酰氯(1,2-Dimethylimidazole-5-sulfonyl Chloride,DMIS)则可以在很宽线性范围内监测雌二醇特异性定性离子通道。与另一种已知的具有分析物特异性裂解的衍生试剂(吡啶-3-磺酰氯)相比，DMIS具有明显的灵敏度优势。羟胺是可以同时对雌激素、雄激素、皮质类固醇和孕酮的进行衍生[57]。我们前期工作采用了一种羟胺衍生化技术与LC-MS/MS检测技术相结合的方法，可提高用于质谱的电离效率，并同时定量了十种类固醇激素，包括雌激素，雄激素，孕酮和皮质类固醇四类类固醇[58]。目前衍生化技术可以很好地提高雌激素的检测灵敏度，但是定量检测特异性差，用于定量的子离子碎片来源于衍生化试剂并非雌激素[36]。对复杂基质样品进行非特异性的衍生化也增加了共流出的杂质干扰，即很强的基质效应，因此寻找特异性和灵敏度兼具的衍生试剂也是当前研究的难点之一。

3.2 直接LC-MS法

化学衍生化不是改善灵敏度的唯一解决方案。对于不衍生的雌激素通常使用负离子模式进行测定，Yi等[59]使用0.05%氢氧化铵，在流动相中添加氢氧化铵可以使雌二醇适当电离，并使信号最大化，但是在碱性条件下对色谱柱有一定的腐蚀性。氟化铵可在负离子模式下为雌酮和雌二醇提供更好的信号，通常将氟化铵添加到与电喷雾负电离模式结合使用的流动相中以增强未衍生雌激素的信号[9,60,61]。Julianne等[62]在LC的缓冲液中使用0.2 mmol/L氟化铵在负离子下促进雌二醇的电离。通过这种方法提高了雌二醇检测的灵敏度，足以检测男性、绝经前和绝经后妇女血清中的雌二醇，定量限为2.61 pmol/L(0.71 pg/mL)。

4 色谱-质谱雌激素分析检测仪器

4.1 色谱

雌激素的检测难点主要在于灵敏度低和特异性差。17β-雌二醇是雌二醇的活性立体异构体，而其差向异构体17α-雌二醇则没有雌激素活性。为了选择性地定量17β-雌二醇，则需要对这样的异构体进行色谱分离。Yi等[59]使用纳升LC分离雌激素，流速仅为35 μL/min，LC-MS/MS总检测时长为3.5 min，最终在无衍生化的条件下测血清样品的定量限为3.0 pg/mL。二维色谱可以通过减少不必要的LC洗脱液，确保样品在线纯化并减小对质谱检测器的损伤[61,63]。Hemamalini等[14]采用二维色谱对雌激素进行检测，在11 min内进行在线纯化和分离，雌二醇的定量限低至0.3 pg/mL。

4.2 离子源

ESI通过溶剂蒸发产生离子，适用于中等至高极性的分析物[64,65]。在APCI中，雾化的样品通过电晕放电电离，从而提供较强的电离，适用于难以在溶液中形成离子的化合物，因此更适用于这些高脂溶性的类固醇[66,67]。尽管APCI可以提高非极性化合物的电离效率，但很少用于未衍生化的类固醇雌激素[68]。Higashi等[41]利用4-硝基苯甲酰氯在衍生化后引入硝基，使用ECAPCI-MS进行检测，比未衍生化的检测响应提高了8～23倍，血清样本消耗量仅为10 μL。Lien等[69]发现与其它电离源包括APCI相比，ESI对于丹磺酰氯衍生的雌激素化合物的信号强度更高。大气压光电离(APPI)是新兴的电离源，能够使非极性化合物电离，并且不易受到基质效应的影响。衍生物在APPI-MS和APCI-MS中几乎只产生[M+H]+离子，且APPI-MS中衍生物的离子强度低于APCI-MS中的离子强度，但由于APPI-MS中的背景噪声较低，因此可获得更低的检出限[45]。

4.3 质量分析器

静电场轨道阱(Orbitrap)与三重四极杆相比，在检测1-甲基咪唑-2-磺酰基雌激素衍生物方面特异性有了提高[43]，雌激素衍生物用于定量的碎片离子大多数是衍生试剂上的非特异性的碎片离子，Orbitrap MS采用更精确的母离子进行分析物定量，因此无需处理碎片离子，该方法采用选择离子模式监测18种类固醇，检出限可达到0.02～12 pg/mL。Darville等[70]在此基础上进行了方法优化，使用高分辨率(HR)Orbitrap质谱仪量化人尿中所有15种1-甲基咪唑-2-磺酰氯衍生的雌激素和雌激素代谢物，定量限在1～20 pg/mL之间。Li等[71]利用AB Sciex QTRAP系列仪器中的Analyst软件提供的Sum Multiple Ion功能实现5次多反应监测(MRM)模式的采集并进行加和，与未加和的结果相比灵敏度提高了3～4倍。

5 不同生物基质中雌激素的检测研究进展

在各种临床样本中，血清和血浆最为常见，而尿液，唾液等样本由于简单易获取，也越来越多地应用于临床中。测量生物基质中的内源激素的难度在于其低生理浓度和复杂基质的干扰。在尿液和血浆中，类固醇主要以葡醛酸苷、硫酸盐或它们的混合物的形式存在，其他的大多数结合在载体蛋白(如性激素结合球蛋白或白蛋白)上，而未结合或“游离”的浓度极低。因此，很难对生物体液中游离的雌激素进行分离分析[43]。

血液样本已经广泛应用于临床检测，如脐带血、母体血清中雌激素的测定已被纳入产前出血、自闭症或先兆流产的检测中。在胎儿的血清中循环的类固醇激素的浓度比在母亲的血清中浓度高得多，这就意味着可能需要建立更宽的测量范围[72]。血清的样本采集通常需要静脉穿刺，这种作为侵入式的样本采集方法，需要现场有接受专业培训的人员，并且采集到的样本需要在冷冻条件下保存[73]，这些复杂的程序使得血液样本的获取增加了难度。

测量合并的24 h尿液样本已成为研究肾上腺类固醇的重要手段[51]。血浆中仅有少量的类固醇在尿液中原样代谢，其余通过肝脏代谢。每种类固醇都会产生大量肝代谢产物，其中大多数类固醇的代谢物含有额外的羟基并与硫酸盐或葡糖醛酸苷部分相连，所以它们更易溶解，易于被肾脏排泄。Van等[54]设计了一种通过多步固相萃取方法，将样品纯化后，对水溶性较低的部分进行衍生化，仅用6 mL的尿液样本就可以完成包括母体雌激素、羟基化和甲基化形式、16α-羟基雌激素途径的代谢物、硫酸盐和葡糖醛酸化物结合形式的雌激素的分析。

唾液通常被用作生物基质，因为它可以非侵入式取样并且即使在非卧床环境中也很容易收集。此外，大多数循环激素以非生物活性激素的形式与载体蛋白结合，而唾液类固醇激素的浓度与血液中游离的和未结合的激素组分密切相关，因此可轻松获得生物活性激素组分的测量值[71]。Wei等[74]使用API 5000光谱仪与在线SPE相结合的方法，首次实现唾液雌二醇未衍生化的雌二醇的LC-MS/MS分析测定，仅用100 μL唾液同时鉴定和定量唾液样品中的雌二醇和其它六种类固醇激素灵敏度为1 pg/mL。近五年不同生物基质的检测方法如表1所示。

表1 近五年LC-MS/MS检测雌激素汇总

6 结语

精确定量分析生物基质中的雌激素有助于了解生物体的代谢过程和病理学的诊断。近年来，虽然关于LC-MS联用技术检测雌激素的研究已经取得了一定的进展，但是目前还存在一些制约因素：衍生化雌激素一方面取决于衍生化试剂的特性，另一方面也和离子源的离子化效率和碰撞碎裂有关。尽管衍生化技术可以极大地提高质谱检测的灵敏度，但是受到生物基质中的干扰，导致衍生化后基质效应增加，以及无特异性的衍生试剂会对测量结果的准确性造成影响。选择性和灵敏度对于质谱的高通量分析来说依然不可兼得，分离和仪器条件仍然是类固醇检测的制约因素。

基于目前雌激素检测面临的挑战，生物基质中雌激素的LC-MS/MS检测方法有待从以下几个方面进行改善：(1)根据不同基质选用不同的前处理方法以减少基质效应。样本量大且易获得的如尿液、唾液等生物样本，可以利用固相萃取的方法更好的降低背景噪声；根据确定雌激素的参考范围选择衍生化或者不衍生化；(2)寻找特异性更强的衍生化试剂。目前使用的衍生化试剂自身响应信号强，对定量目标化合物会造成干扰。因此，有必要开发能够产生与雌激素结构关联的碎片离子的衍生化试剂；(3)进一步改进和发展质谱检测技术，例如，使用纳升色谱，二维色谱进样，为雌激素的检测提供硬件支持。

随着越来越多样品前处理方法的出现，新的化学衍生试剂不断被发现，LC-MS分析方法的研究与开发，LC-MS雌激素分析技术有望成为临床病理研究和诊断领域的重要方法，并日益广泛的应用于化学、医学等领域中。