基于网络药理学的宣白清肺解毒汤治疗新型冠状病毒肺炎作用机制研究与初证

巨红叶， 赵国望， 韩立柱， 王晓玲， 崔翔， 宋逍， 唐志书， 宋在鑫

(1. 安康市中医医院制剂中心， 陕西 安康 725000； 2. 陕西中医药大学药学院， 陕西 咸阳 712046)

新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)是一种急性呼吸道传染病，具有发病迅速、传播广泛、传染性强的特点，临床主要表现为发热、干咳、乏力、呼吸困难、呼吸窘迫综合征等[1]。根据国家卫健委、国家中医药管理局《关于印发新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)》，中医辨证中的疫毒闭肺证所用的处方为麻杏宣白承清肺汤加减[2]。我院专家根据安康地区COVID-19的中医证候分布特点，在此基础上增加浙贝母、鱼腥草和金银花，发挥清肺解毒的作用，将其命名为宣白清肺解毒汤。宣白清肺解毒汤综合了麻杏仁甘石汤、宣白承气汤、达原饮三方化裁而成，包括麻黄、鱼腥草、浙贝母、金银花、大黄、石膏、桃仁等共13 味药。全方合用宣肺平喘，清肺解毒，清泻兼顾，以泻代清，肺与大肠同治，治气分防血分；又可化浊辟秽，故可用于寒湿郁肺及疫毒闭肺证。

2020年2月18日纳入安康市传染病院共24例COVID-19患者，其中22例诊断为寒湿郁肺证，2 例疫毒闭肺证，采用柴平汤及我院制备的宣白清肺解毒汤，从发病到症状完全消失，其中最短为2 d，最长为18 d，平均7.66 d。截至2020年2月24日，17例患者治愈出院，无一例病情加重[3]。此方相继在我市疑似COVID-19患者，社区获得性肺炎中观察具有一定的疗效。

网络药理学是基于系统生物学、多向药理学和计算机生物科学，通过数据库筛选及分析，用于预测和研究多种药物活性化合物作用于多靶点、多条通路及相关疾病发生的作用机制[4-5]。本研究旨在网络药理学的基础上，筛选出宣白清肺解毒汤治疗COVID-19的活性化学成分，并对相关作用靶点进行聚类分析及代谢通路分析，为研究其可能的药效作用途径提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 宣白清肺解毒汤主要活性化合物的筛选

利用TCMSP数据库(http：∥tcmsp.com/tcmsp.php)对13 味中药所含活性成分及其性味归经信息进行检索，设定参数口服生物利用度(OB)≥30%，药物相似性(DL)≥0.18，分子量(MW)≤500， 氢键受体数目(Hacc)<10，氢键给体数目 (Hdon)<5，分别构建宣白清肺解毒汤化学成分及其归经信息数据库。

1.2 靶标网络构建和相关疾病靶点的收集

利用TCMSP数据库查询13味中药活性化合物对应的靶标信息，构建靶标信息库，并通过Uniprot数据库使其标准化，得到关键靶点的基因名。利用GeneCards数据库(http：∥www.genecards.org/)检索与COVID-19相关的基因。

1.3 化合物-疾病-靶点网络及PPI网络的构建

利用STRING数据库(https：∥string-db.org/)录入宣白清肺解毒汤治疗COVID-19相关靶点，在“organism”中选择“homo sapiens”进行检索，获得蛋白相互作用关系并进行PPI网络分析，采用Cytoscape 3.7.2软件构建化合物-疾病-靶点网络，并进行模块化分析。

1.4 宣白清肺解毒汤治疗COVID-19靶点富集分析

在DAVID数据库(https：∥david.ncifcrf.gov/)中对宣白清肺解毒汤治疗COVID-19靶点相关通路进行GO和KEGG富集分析，设定阈值P<0.05，使用R软件对富集结果进行生物功能的可视化分析。

1.5 成分-靶点对接

从宣白清肺解毒汤中选取核心活性化合物山柰酚、β-谷甾醇和木犀草素与COVID-19相关的血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)进行对接，从RCSB数据库下载相关蛋白结构，并使用AutoDock软件进行加氢、加电子、加ROOT等操作。本次研究设定结合能小于-5 kJ/mol为结合显著性，以此佐证宣白清肺解毒汤作用于COVID-19的合理性。

2 结果

2.1 宣白清肺解毒汤活性化学成分分析

利用TCMSP数据库对13味中药所含活性成分进行检索，按照类药五原则筛选得到122个活性成分，其中麻黄15个，浙贝母5个，鱼腥草5个，苦杏仁17个，瓜蒌10个，大黄6个，金银花15个，苍术9个，槟榔5个，草果5个，桃仁22个，葶苈子8个，去掉重复值后共99个。通过在线Venny软件分析此方交集化合物可知：山柰酚为麻黄、鱼腥草、金银花、葶苈子共有；木犀草素为麻黄、金银花共有； β-谷甾醇为麻黄、浙贝母、大黄、金银花、桃仁、葶苈子共有。具体交集化合物参数如表1所示。

表1 宣白清肺解毒汤中交集化合物

2.2 药物-化合物-靶点网络

将得到的活性化合物通过TCMSP数据库预测靶点，共得到638个靶点蛋白，利用Cytoscape软件构建草药-化学物成分-靶点网络。其中黄色代表中药，紫色代表各药物独有的化学成分(每个中药用其首字母缩写代表)，蓝色代表共有活性化合物(A1～J1)，绿色代表靶点。通过在线分析网络图的拓扑性质，以节点的大小表示度值的大小。由图1可知，网络图包括319 个节点，1 094 条边，其中度值最大的前3位药材分别是桃仁(16)、金银花(14)、麻黄(13)。度值最大的前3位药物活性成分分别为A1、C1、B1；所对应的化合物及度值分别为山柰酚(252)、β-谷甾醇(126)、木犀草素(101)。按度值由大到小排名前3的靶点分别为NCOA2、PTGS2、GABRA1。

图1 草药-化合物-靶点网络图

2.3 预测宣白清肺解毒汤治疗COVID-19靶点

根据Genecards数据库找到COVID-19相关治疗靶点259 个，运用Venny平台查找宣白汤与COVID-19靶点交集，得到35 个共有靶点，如图2所示。

图2 交集靶点韦恩图

2.4 PPI网络构建

通过String在线分析35个共有靶点，并设置参数去掉游离靶蛋白，得到PPI核心网络图(图3)， PPI网络图共包括34个节点，350条边。通过Cytoscape 3.7.2软件对网络图进行分析，结果显示靶蛋白平均节点度值为20.6，最大值为30，最小值为4，高于平均度值的靶点共23个，其中度值>25有13个，这些靶点可能是参与宣白清肺解毒汤治疗COVID-19的关键靶点。关键靶点及度值信息如表2所示。

表2 宣白清肺解毒汤关键靶点信息

图3 宣白清肺解毒汤PPI网络图

2.5 靶点通路GO富集分析

从DAVID数据库中筛选GO富集分析得到GO条目共192个，其中细胞组成条目16个，生物学过程条目157个，分子功能条目19个。通过R软件对结果进行可视化分析，得到GO富集分析气泡图(图4～图6)。其中横坐标表示富集因子，纵坐标表示富集条目，气泡的大小表示富集个数，气泡的颜色表示P值大小。生物学过程基因参与最多的条目及个数分别为缺乏配体的外源性凋亡信号通路(14)、药物反应(14)、脂多糖介导信号通路(13)；细胞组成过程基因参与最多的条目及个数分别为：细胞质(22)、胞质溶胶(20)，细胞核(19)；分子功能过程基因参与最多的条目及个数分别为：蛋白结合(30)、相似蛋白结合(13)、蛋白均聚活性(12)。

图4 宣白清肺解毒汤核心作用靶点BP气泡图

图5 宣白清肺解毒汤核心作用靶点CC气泡图

图6 宣白清肺解毒汤核心作用靶点MF气泡图

2.6 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集筛选得到35个富集条目(P<0.01)，如图7所示。其中与疾病相关的条目为结核病、乙型肝炎、美洲锥虫病等，以及癌症通路、PI3K-Akt信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等相关通路条目。对KEGG的35条结果进行聚类分析，可得到8类，其中计数>10的分别为乙型肝炎(14)、美洲锥虫病(13)、TNF信号通路(10)、甲型流感(10)、阿米巴原虫病(10)。

图7 核心活性靶点KEGG代谢通路气泡图

2.7 成分-靶点分子对接结果

如图8所示，3种核心化合物与ACE2结合能均小于-5 kJ/mol ，结构稳定，结合活性较高，说明该类化合物可以直接作用于宿主人体细胞，提高机体免疫力，阻断病毒侵袭。

A：山柰酚-ACE2：结合能-5.04 kJ/mol；结合位点：ASP543，GLU310，ASN546，SER545；B：β-谷甾醇-ACE2：结合能-6.24 kJ/mol；结合位点：GLU549；C：木犀草素-ACE2：结合能-5.1 kJ/mol；结合位点：SER411；GLN-526

3 讨论

中药复方组分自身的复杂性决定了其通过多成分作用于多个不同靶点而形成多维药理发挥体系，从而达到治疗疾病的目的[6]。本研究利用网络药理学的技术和方法，通过数据挖掘共找到宣白清肺解毒汤的活性化学成分122个，靶点1 038个，与COVID-19交集靶点35个，GO富集分析192条，KEGG富集分析得到35个条目，聚类分析得到8类不同通路。

宣白清肺解毒汤性味归经分析结果显示，前5个度值最高的中药活性化合物为山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素、常春藤苷元、汉黄芩素。COVID-19危重症的临床表现为急性呼吸窘迫综合征和急性肺损伤，其可能与革兰氏阴性菌产生的内毒素(脂多糖)及感染导致的脓毒症有关[7]。研究表明，山柰酚、β-谷甾醇可以减轻脂多糖导致的小鼠急性肺损伤[8-9]；而木犀草素、常春藤苷元和汉黄芩素均具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等多种生物活性[10-11]。

在PPI网络图中得到与COVID-19交集自由度较高的靶点有BCL2L1、TP53、Bad、CASP8、CASP3。BCL2L1为最经典的抗凋亡基因，同时又能调控自噬，与PPAR-γ、NF-κB、HIF-1 等信号通路有关[12]。TP53为常见促癌基因，其突变主要与肿瘤的恶性进展、复发等存在一定的关联[13]。Bad是bcl-2家族新发现的一种凋亡促进基因，可与TP53在线粒体上形成Bad/p53复合物，通过诱导Bak的活化和寡聚化从而诱导细胞凋亡[14]。

GO富集结果显示，在生物学过程富集条目最多的是缺乏配体的外源性凋亡信号通路、药物反应、脂多糖介导信号通路等。严重的获得性肺炎患者表现出活性氧、 TNF-α和IL-6显著增加[15]。从KEGG富集分析结果可知，在治疗过程中涉及的通路主要有癌症通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B、PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路等。研究表明，PI3K/AKT信号通路在肺癌发生发展中起重要作用，通过抑制PI3K/AKT 信号通路蛋白表达和细胞生长，从而诱导细胞凋亡和抑制细胞生长，达到抗肿瘤的效果[16]。TNF信号通路是参与炎症反应和免疫的主要通路之一，在炎症反应中起重要作用。由此推测，宣白清肺解毒汤通过抑制炎症浸润、诱导细胞凋亡、调节免疫等治疗COVID-19。

分子对接结果显示，山柰酚、β-谷甾醇和木犀草素3种核心化合物与ACE2蛋白活性酶具有稳定的结合活性，能通过直接作用于宿主人体细胞发挥阻断病毒侵袭的作用，提示宣白清肺解毒汤所含活性化合物具有调控COVID-19相关靶标的生物活性，具有一定的临床防控新冠病毒的潜力，这与我们的临床试验结果相符。

本研究基于网络药理学，运用相关数据库，检索宣白清肺解毒汤活性化合物及潜在靶点，分析与COVID-19交集靶点，并进一步预测与靶点相关的通路及疾病信息，说明宣白清肺解毒汤是通过多成分协同作用于多靶点及多个通路从而发挥治疗COVID-19的作用，后期还需进行相应的实验加以验证，确保其结果的准确性、科学性和可靠性。