FoxM1对肝癌患者行根治性手术切除联合TACE治疗反应性及预后的关系*

薛 秋

(江苏省南通市肿瘤医院普外科，南通 226361)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球第五大常见肿瘤，发病率高且预后较差。除少部分患者适于手术切除、肝动脉化疗栓塞、射频消融和肝移植等治疗外，大部分患者的治疗效果和预后均不理想。经导管肝动脉化疗栓塞术(transcatheter arterial chemoembolization,TACE)在世界范围内被用于治疗中期HCC 患者，主要适用于肿瘤巨大且多发、不能手术切除的肝功能正常患者[1]。TACE 通过导管将化疗药物打到肿瘤主要供血血管内，达到控制肿瘤生长和细胞减灭作用。然而随着治疗次数和时间的延长，5 年生存率仅7.5%，且易发生肝内多发转移[2]。原癌基因的激活或高表达和抑癌基因的失活是使正常细胞走向恶化的根本原因。因此，靶向癌基因驱动的精确癌症治疗策略一直是现今的研究热点[3]。

叉头框(forkhead box,Fox)家族包含多种组织和细胞类型的特异性转录因子，具有保守的翼状螺旋DNA 结合域(DNA binding domain,DBD)或叉头结构域。Fox 转录因子家族成员通常被认为是胚胎发生和细胞内稳态过程中生理发育的重要调节因子。自第1 个Fox 基因被发现以来，根据蛋白质序列同源性(FoxA～FoxS)，人类50 个Fox 编码基因被分为19个亚家族[4]。尽管Fox 转录因子的每个亚家族都具有重要的生物学意义，但FoxA、FoxM1、FoxO、FoxC 和FoxP 受到广泛关注，尤其在癌症研究中。FoxM1 目前被认为是多种癌症的重要调节因子，其过度表达对肿瘤的发生、发展和耐药具有重要意义。FoxM1 的过度表达在癌症中很常见，其高表达与患者的生存率差有关[5]。为探讨FoxM1 在HCC 中的表达及其在TACE 治疗中的评估价值，本研究探讨了FoxM1 的表达水平对HCC 患者TACE 治疗反应性及预后的关系，为FoxM1 作为判断HCC 患者TACE 治疗后肿瘤复发、预后的预测因子提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集2011 年1 月—2014 年12 月南通市肿瘤医院标本库中的HCC 标本共114 例，其中男91 例，女23 例；年龄21～75 岁，中位年龄49.28岁。入选条件：(1)术前均未行放、化疗和手术治疗；(2)无介入治疗禁忌证；(3)未合并其他恶性肿瘤及严重内科疾病，一般状况良好。收集患者临床信息如年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、TNM 分期、肿瘤数目、肝内转移情况、肿瘤包膜是否完整、淋巴结转移情况、是否乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)表达情况、肝纤维化水平、是否门静脉侵犯等。

1.2 治疗方法 行根治性手术切除，手术切缘>2 cm。癌及癌旁组织标本经手术切除后装冻存管置液氮保存备用。经病理证实为HCC 患者，术后1 个月开始行常规2～4 次辅助性TACE 治疗，操作过程按照TACE 技术操作规范执行。化疗方案：顺铂(65 mg/m2)为基础的化疗方案，每4 周重复1 次。本研究经南通大学伦理委员会及南通市肿瘤医院医学伦理委员会审核通过。治疗前均经患者和家属充分知情同意，并签署知情同意书，无手术及化疗禁忌证。

2015—2017年参加湖北省小麦区域试验，两年平均产量为 5 909.85 kg／hm2，较对照郑麦 9023 增产5.19%。 其中 2015—2016 年平均产量为 6 455.40 kg／hm2， 较对照增产 7.27%， 增产极显著；2016—2017 年平均产量为 5 364.30 kg／hm2，较对照增产2.81%，增产显著。

将复染后的石蜡切片进行扫描，将所得到的切片光密度值进行测量和统计，在114 例HCC 病例中，FoxM1 高表达75 例(65.79%)(FoxM1 高表达组)，FoxM1 低或不表达39 例(34.21%)(FoxM1 低/不表达组)。FoxM1 高表达组癌中FoxM1 的表达水平高于癌旁组织(P<0.001,图2A)；而在FoxM1 低/不表达组差异无统计学意义(P=0.097 8,图2B)；FoxM1 表达水平=癌中FoxM1 表达值/癌旁FoxM1 表达值，发现FoxM1 高表达组的FoxM1 表达水平明显高于FoxM1 低/不表达组(P<0.001,图2C)。

2.1 FoxM1 在HCC 患者癌及癌旁组织中的表达收集所有HCC 癌及癌旁组织石蜡样本进行FoxM1免疫组织化学染色，结果显示FoxM1 在癌组织中呈深褐色染色，主要表达于肿瘤细胞质和细胞核中(图1)。

2.3 FoxM1 高表达对HCC 患者行根治性手术切除联合TACE 治疗后DFS 的影响 随访HCC 患者5年的DFS，单因素回归分析结果发现，患者5 年的DFS 与性别、年龄、肿瘤的分化程度、肿瘤包膜是否完整、脉管是否受侵犯没有显著关系，但与患者的肿瘤大小、TNM 分期、肝内肿瘤数目、区域淋巴结转移、HBV 感染情况，AFP 表达水平，肝硬化程度，FoxM1 高表达间显著相关(表2)。

设计了桥梁高速施工中大跨径连续施工技术，首先通过正向分析法，对大跨径桥梁进行正向分析，对桥梁评价指标进行实时获取。然后建立桥梁高速施工控制策略并进行控制计算，明确控制参数结果。最后实行施工监测，保证施工数据和理论数据相一致，实现桥梁大跨径连续高速施工。实验证明，设计的大跨径连续施工技术施工精确度和施工效率更高，具有推广价值。

2 结 果

1.4 免疫组织化学结果判定 免疫组织化学切片在400 倍光镜下观察，每张切片观察5 个高倍视野，采用IPWIN60 软件进行图像分析，测量FoxM1 表达的光密度值。根据着色的深浅进行评分：FoxM1 阴性，细胞不着色，记0 分；弱阳性，细胞呈淡黄色，记1 分；阳性，细胞呈棕黄色，记2 分；强阳性，细胞呈深棕黄色，记3 分。标志物敏感性评价：++～+++为阳性，0～+为阴性。

周肇祥《琉璃厂杂记》中有一节记：“北汉刘铢用法刻深，民有过者，问其年几何，对以若干，即随其数杖之，谓之随年杖。”我好奇，怕是传说，查了一下，原来这一段出自《新五代史》，确有其事。据记这位刘大人曾做过开封府尹，当年不知有多少人被他这随年杖打怕了？

1.3 免疫组织化学 实验步骤按GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫组织化学检测试剂盒说明书进行。石蜡切片常规脱蜡至水；将切片浸泡在枸橼酸钠缓冲液(pH=6.0)中，95～100 ℃抗原修复20 min；中性磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered solution,PBS)洗3 次，5 min/次；3%H2O2避光孵育15 min；PBS 洗3 次，5 min/次；室温下免疫染色封闭液孵育1 h；FoxM1一抗(兔抗，1∶100 稀释)，室温孵育1 h；PBS 洗3 次，5 min/次；滴加标记有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)和抗兔免疫球蛋白的多聚体分子二抗(GTVisionTMⅢ型，A 液)于切片上，常温孵育1 h；PBS 洗3 次，5 min/次；滴加显色剂3,3′-二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)工作液，室温孵育5～10 min，或光镜下控制显色；蒸馏水冲洗终止显色，苏木精复染20 min；盐酸乙醇分色，梯度乙醇脱水、二甲苯透明，封片胶封片。

图2 FoxM1 在HCC 癌中和癌旁组织的表达情况

进一步多因素回归分析发现，患者的5 年DFS与肝内肿瘤数目、FoxM1 高表达显著相关，与其他因素无关(表2)。术后临床资料分析发现FoxM1 与肝内肿瘤数目显著相关(表1)，由此可见FoxM1 高表达可作为影响HCC 患者治疗效果和评估患者术后肿瘤复发和转移的独立预后影响因素。

表1 HCC 患者FoxM1 表达水平与临床病理学特征的相关性

在农村，上大学，找个体面工作，是许多普通农家的期望，但是河南省正阳县慎水乡台天村民兵连基干民兵牛超，却选择了回乡创业。

2.2 HCC 患者FoxM1 表达水平与临床病理学特征的相关性 本研究采集了根治性手术切除后行TACE 治疗的114 例HCC 患者的基本信息，包括性别、年龄、肿瘤直径、分化程度、肝内肿瘤个数、区域淋巴结转移，包膜是否完整、有无血管侵犯、TNM 分期、AFP 水平、HBV 感染、肝硬化等。结果发现FoxM1高表达与肝内肿瘤数目显著相关(χ2=8.050,P=0.005)，与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤的分化程度、肿瘤的TNM 分期、AFP 表达水平、区域淋巴结转移、肿瘤包膜是否完整、HBV 感染情况、肝硬化程度、脉管是否受侵犯均无关(均P>0.05)(表1)。

1.5 统计学方法 应用SPSS 20.0 统计软件包进行数据处理。组内比较采用Wilcoxon non-parametric signed-rank 检验，组间比较采用Mann-Whitney U 检验。FoxM1 的表达水平与患者的一般临床资料采用χ2检验。无病生存期(disease free survival,DFS)从手术日期至影像学上再次发现HCC 复发或转移、或末次随访日期计算。单因素Cox 比例风险回归进行患者5 年的DFS 生存分析，单因素回归分析中的显著因素进一步纳入多因素回归分析。FoxM1 高表达与FoxM1低/不表达患者的DFS 两两比较采用Kaplan-Meier survival 分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

表2 影响HCC 患者行根治性手术切除联合TACE 治疗后DFS 的因素分析

Kaplane-Meier 生存分析患者行根治性手术切除联合TACE 治疗后的DFS，将FoxM1 高表达与FoxM1 低/不表达患者的DFS 进行两两比较：其中位生存时间为18 个月vs 27 个月，FoxM1 高表达患者DFS 显著低于FoxM1 低/不表达患者(Log-rank test=4.949,P=0.026,图3)，说明FoxM1 的高表达降低了HCC 患者的DFS，由此说明FoxM1 的表达水平是影响HCC 患者术后辅助性介入治疗效果的独立影响因素。

(三)在财政层面，监管不到位，由于非税局人员力量薄弱，没有将“征、管、查”有效地结合起来，使得非税监管工作开展不到位。同时，受到财力分成的负面作用影响，对非税收入往往并不是应缴尽缴，而是会视财政调度收入进度情况和本镇街收入完成情况酌情上缴，造成人为调节收入的现象。

图3 FoxM1 的表达水平对HCC 患者TACE 治疗后DFS 的影响

3 讨 论

Fox 基因家族是2000 年统一命名的一大类功能各异的“翼螺旋”转录因子。FoxM1 是Fox 转录因子家族成员之一，与细胞增殖、胚胎发育、衰老、再生和肿瘤等许多病理生理过程密切相关。FoxM1 信号在细胞发育途径中起重要作用，包括维持细胞增殖和凋亡之间的动态平衡，因此FoxM1 基因的非正常激活已成为癌变组织的重要特征之一。研究[6]表明，FoxM1 增强了小鼠鼻咽癌细胞系的致瘤能力，促进了肿瘤的增殖、细胞周期的进展、迁移和应力纤维的形成，提示FoxM1 能显著诱导鼻咽癌的进展和肿瘤干细胞特征。通过miR-216b 靶向抑制FoxM1，可以抑制裸鼠体内黑色素瘤细胞的生长，而miR-216b过度表达对黑色素瘤细胞生长和增殖的影响被FoxM1 过度表达逆转[7]。FoxM1 在许多人类癌症中过度表达，特别是乳腺癌，与靶向治疗和化疗的耐药性密切相关，抑制FoxM1 转录因子功能已经成为克服乳腺癌进展的一种潜在策略[8]。

艾剑刚等[9]发现，HCC 患者癌组织中FoxM1 蛋白表达水平与组织和血清中AFP 表达水平呈正相关，下调FoxM1 表达可明显抑制HepG2 和HepG2.2.15细胞分泌AFP，而过表达FoxM1 可明显促进HepG2和HepG2.2.15 细胞表达和分泌AFP，提示HCC 中FoxM1 可能在促进AFP 表达中发挥重要作用。高表达的FoxM1 对多种化疗药物有直接或间接抵抗作用，如蒽环类的表阿霉素、顺铂、他莫昔芬、赫塞汀、吉非替尼等[10]。最近研究[11]发现通过microRNAs 抑制FoxM1 的表达能够提高肝癌细胞株对紫杉醇的药物敏感性，从而促进肿瘤细胞的凋亡。作为重要的分子肿瘤标志物，FoxM1 的表达水平可用于预测肝癌患者肝移植的预后，FoxM1 低表达患者术后的无复发生存期和总生存期明显高于FoxM1 高表达患者[12]，可见FoxM1 高表达能使肝肿瘤细胞产生耐药性，影响患者的预后，但FoxM1 的表达与HCC 患者行根治性手术切除联合TACE 治疗后的反应性及预后的关系尚未见报道。

本文为回顾性研究，研究FoxM1 的表达水平对以顺铂为主的TACE 介入化疗效果的影响，发现FoxM1 高表达与肝内肿瘤的数目密切相关，患者5年DFS 与肝内肿瘤数目、FoxM1 高表达之间有统计学意义，FoxM1 高表达者经TACE 介入化疗后DFS明显少于低表达者。说明FoxM1 高表达与肿瘤的转移及耐药株的形成有着一定的相关性，具体是通过什么通路发挥作用，还需进一步的研究。在恶性间皮瘤中FoxM1 和Hippo 信号通路之间具有相关性，抑制Hippo 信号通路，能导致FoxM1 过表达，促进肿瘤的形成[13]。此外，FoxM1 和Hippo-Yes 相关蛋白(yesassociated protein,YAP)表达呈正相关，通过对细胞系、转基因小鼠和肝癌组织的分析发现，YAP 与FoxM1 协同作用导致染色体不稳定，而阻断这一途径的药物可能被开发成肝癌的治疗方法[14]。FoxM1的作用模式是通过激活细胞周期进程调节因子、抗氧化基因和上皮细胞-间充质转化表型、侵袭和转移前生态位形成来促进癌细胞逃避生长抑制物[15]。

综上所述，FoxM1 是一种重要的增殖相关转录因子，在细胞周期中广泛表达，与细胞增殖、自我更新和肿瘤发生密切相关。本研究发现FoxM1 在HCC癌组织中高表达，与肝内肿瘤数目密切相关，FoxM1可作为评估HCC 患者行TACE 预后疗效的独立分子指标，用于判断患者TACE 治疗效果，是一个新的判断HCC 患者术后辅助性介入治疗效果的预后因子。该研究为FoxM1 作为HCC 治疗靶基因提供重要依据。