中药济生散对肺癌细胞增殖、周期和凋亡作用的研究*

景 瑾，杨晓慧，刘 春*，顾小侠***

(1 南通大学杏林学院，南通 226200；2 南通大学实验动物中心；3 江苏省南通市中医院肿瘤科)

肺癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一[1]。抗癌药物在肺癌中的治疗必不可少，传统抗癌药物虽然应用广泛，但毒副作用、治疗效果等问题仍然存在，因此研发新型抗肺癌药物意义重大。在癌症治疗中，中医中药具有保护脏器、调节免疫功能、抑瘤抗癌、改善症状等作用[2]。济生散是南通市中医院肿瘤科经过二十多年临床研究，自创用于肺癌治疗的药方，临床疗效良好[3]。济生散中的主要中药成分有黄芪、沙参、太子参、蛇舌草、仙鹤草、莪术等。方中黄芪、沙参、太子参益气养阴；仙鹤草补虚扶正治本；蛇舌草清热解毒散瘤；莪术化淤治标。其作用机制有必要深入研究。

本研究通过济生散浓度梯度、时间梯度分别作用于人正常肺上皮细胞(BEAS-2B)、人肺腺癌细胞(A549、H1975)，观察细胞形态变化，检测细胞增殖、周期和凋亡水平的变化，以期揭示中药济生散的抗癌作用机制，为济生散的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 BEAS-2B、A549、H1975 细胞购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。

1.1.2 中药济生散 济生散方由南通市中医院中药房提供，主要成分：黄芪30 g、沙参15 g、太子参15 g、蛇舌草30 g、仙鹤草30 g、莪术10 g，常规煎煮成含生药2 g·mL-1，0.22 μm 滤膜过滤除菌，4 ℃保存备用，1 个月内用完。

1.1.3 主要仪器及试剂 CO2细胞培养箱购自Thermo 公司；倒置相差显微镜、光学显微镜购自Leica 公司；抗生素、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸、0.25%胰蛋白酶购自Gibco 公司；胎牛血清、DMEM 基础培养基购自Hyclone 公司；培养瓶购自Corning 公司；细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)试剂盒、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、传代和冻存 BEAS-2B、A549、H1975 细胞于37 ℃，5%CO2培养箱中常规培养；待细胞密度长至80%～90%后，细胞1∶3 传代或冻存。

1.2.2 济生散浓度梯度刺激BEAS-2B、A549、H1975细胞 待BEAS-2B、A549、H1975 细胞长至80%时，胰酶消化，离心去上清，细胞计数，以每孔5 000 个细胞100 μL 接种于96 孔板。细胞培养过夜，以磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)为对照，以1、2、4、6、8、10、15、20 μL 济生散分别刺激细胞24 h，空白对照组只加入培养基不加细胞，药物对照组加培养基和10 μL 济生散不加细胞，每组设6个复孔取均值，实验重复3 次。在济生散刺激0、24、48、72 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，继续培养4 h 后，在酶标仪A 450 nm 处测量各孔的吸光度值。

1.2.3 济生散时间梯度刺激BEAS-2B、A549、H1975细胞 每孔5 000 个细胞100 μL 接种于96 孔板。细胞培养过夜，以PBS 为对照，2 μL 济生散分别刺激细胞2、4、6、8、10、12、24 h 和不换液持续刺激。空白对照组只加入培养基不加细胞，药物对照组加培养基和2 μL 济生散不加细胞，每组设6 个复孔取均值，实验重复3 次。在济生散刺激0、24、48、72 h后CCK-8 法测细胞活力。

1.2.4 A549、H1975 细胞形态观察 取对数生长期细胞，胰酶消化，离心去上清，接种于6 孔板，细胞培养过夜，根据96 孔板和6 孔板的底面积以及培养基量换算选择32 μL 济生散浓度刺激A549、H1975 细胞8 h，以PBS 刺激为对照。培养24 h 细胞长至60%～70%时，弃完培，PBS 洗涤细胞2 次，倒置相差显微镜下观察拍照。

1.2.5 BEAS-2B、A549、H1975 细胞活力检测 每孔5 000 个细胞100 μL 接种于96 孔板。细胞培养过夜，以PBS 为对照，2 μL 济生散刺激细胞8 h，在济生散刺激0、24、48、72 h 后CCK-8 法测BEAS-2B、A549、H1975 细胞活力。

1.2.6 BEAS-2B、A549、H1975 细胞周期检测 取对数生长期细胞传代，贴壁，32 μL 济生散刺激8 h后，继续培养至对照组长至80%左右，胰酶消化，收集细胞。70%乙醇4 ℃固定2 h，离心，PBS 洗细胞1次。每管细胞样品中加入0.5 mL 碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色液，37 ℃避光温浴30 min。流式细胞仪检测，每组细胞3 个复孔，重复3 次。

1.2.7 BEAS-2B、A549、H1975 细胞凋亡检测 取对数生长期细胞传代，贴壁，32 μL 济生散刺激8 h后，继续培养至对照组长至80%左右，胰酶消化，收集细胞。用凋亡试剂盒中的缓冲液重悬细胞，然后依次加入两种染液AV 和PI 各5 μL，并设3 个对照组，分别为空白单染PI、空白单染AV 及全空白组，室温下避光反应20 min，流式细胞仪检测。右上象限为晚期凋亡细胞和右下象限为早期凋亡细胞，每组细胞3 个复孔，重复3 次。

1.2.8 统计学方法 所有实验计量数据均采用STATA 16.0 统计学软件进行处理，应用GraphPad Prism 5 统计分析软件作图。数据结果以表示，采用配对t 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 济生散浓度梯度对BEAS-2B、A549、H1975 细胞的影响 在BEAS-2B 细胞中(图1A)，济生散刺激24 h 后，1、2 μL 组细胞活力较PBS 组显著上升(P<0.05)，4、6、8、10 μL 组与PBS 组比较差异无统计学意义(P>0.05)，15、20 μL 组较PBS 组显著下降(P<0.05)。济生散刺激48 h 后，2 μL 组细胞活力较PBS 组显著上升(P<0.05)，1、4、6、8 μL 组与PBS 组比较差异无统计学意义(P>0.05)，10、15、20 μL 组较PBS 组显著下降(P<0.05)。济生散刺激72 h 后，1 μL 组细胞活力较PBS 组显著上升(P<0.05)，2、4、6、8、10 μL 组与PBS 组比较差异无统计学意义(P>0.05)，15、20 μL 组较PBS 组显著下降(P<0.05)。

在A549 细胞中(图1B)，济生散刺激24 h 后，济生散所有组细胞活力均较PBS 组显著下降(P<0.05)。济生散刺激48 h 后，1 μL 组细胞活力较PBS 组有所下降，但差异无统计学意义(P>0.05)，其他组均显著降低(P<0.05)。济生散刺激72 h 后，济生散所有组细胞活力均较PBS 组显著下降(P<0.05)。

在H1975 细胞中(图1C)，济生散刺激24、48、72 h 后，济生散所有组细胞活力均较PBS 组明显下降(P<0.05)。

图1 济生散浓度梯度对BEAS-2B、A549、H1975 细胞活力的影响

2.2 济生散时间梯度对BEAS-2B、A549、H1975 细胞的影响 在BEAS-2B 细胞中(图2A)，济生散2 μL刺激2、4、6、8 h 后，细胞活力有所上升(P<0.05)；刺激10、12、24 h 后，细胞活力差异无统计学意义(P>0.05)；若持续刺激至48、72 h 时，活力显著下降(P<0.05)。在A549 细胞中(图2B)，济生散2 μL 刺激2 h 后，细胞活力差异无统计学意义(P>0.05)；济生散2 μL 刺激4 h 后，细胞活力在48 h 和72 h 时显著降低(P<0.05)；济生散2 μL 刺激6 h 及更长时间后，细胞活力显著下降(P<0.05)。在H1975 细胞中(图2C)，济生散2 μL 刺激2 h 及更长时间后，细胞活力均显著下降(P<0.05)。

图2 济生散时间梯度对BEAS-2B、A549、H1975 细胞的影响

2.3 A549、H1975 细胞形态观察 中药济生散浓度煎至2 g·mL-1，32 μL 刺激A549、H1975 细胞8 h，以PBS 刺激为对照。培养24 h 后倒置相差显微镜下观察细胞形态，A549 细胞呈上皮样、多角形贴壁生长，H1975 细胞呈上皮样、长梭形贴壁生长，A549(图3)、H1975(图4)济生散组细胞数量显著减少，80%以上皱缩变圆，折光率发生变化，且贴壁不牢。

图3 相差显微镜下A549 细胞形态观察

图4 相差显微镜下H1975 细胞形态观察

2.4 济生散对BEAS-2B、A549、H1975 细胞活力的影响 中药济生散浓度煎至2 g·mL-1，2 μL 刺激BEAS-2B、A549、H1975 细胞8 h，以PBS 刺激为对照，CCK8 法检测细胞增殖水平(图5)。结果显示：济生散处理后，BEAS-2B 细胞活力无影响，A549 和H1975 增殖水平均显著下降(P<0.05)。

图5 济生散对BEAS-2B、A549、H1975 细胞增殖的影响

2.5 济生散对A549、H1975 细胞周期的影响 PI单染流式细胞术分析济生散处理后BEAS-2B、A549和H1975 细胞周期中各时期的细胞百分数，BEAS-2B 细胞在济生散处理后无明显变化(图6A)；A549细胞在济生散处理后(图6B)，G1期细胞比例显著下降(P<0.05)；S 期细胞比例显著上升(P<0.01)；G2期细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)。H1975 细胞在济生散处理后(图6C)，G1期细胞比例显著下降(P<0.01)；G2期、S 期细胞比例显著上升(P<0.01)。说明济生散可显著影响A549 和H1975 细胞的细胞周期分布，并使细胞周期阻滞于S 期。

图6 济生散对BEAS-2B、A549、H1975 细胞周期的影响

2.6 济生散对BEAS-2B、A549、H1975 细胞凋亡的影响 通过流式分析检测发现，与PBS 组相比，济生散处理后，BEAS-2B 细胞无明显变化(图7A)；A549细胞早期凋亡比例极显著上升(P＜0.01)(图7B)；H1975细胞的凋亡比例无论是早期凋亡还是晚期凋亡均显著上升(P＜0.05)(图7C)。说明济生散可显著促进A549和H1975 细胞的凋亡。

图7 济生散对BEAS-2B、A549、H1975 细胞凋亡的影响

3 讨 论

近年来，世界范围内肺癌死亡率呈增加趋势，且逐步成为死亡率上升最快的癌症[4]。目前，肺癌的主要治疗手段仍然是手术治疗、化疗放疗、靶向治疗、免疫治疗等，但其生存率仍不理想[5]。中医中药在我国已有千年历史，肺癌在中医学中属于“肺积”、“咳嗽”、“息贲”、“咯血”、“胸痛”、“肺岩”等范畴。肺癌患者主要症状有咳嗽、咯痰、疲倦、乏力、气促、口干、胸痛、头痛、头晕、纳呆、眠差等表现。中医在肺癌的治疗方面具有显著优势，就病因病理机制而言，肺癌是因虚得病，正虚不仅是肺癌发生的内因，也是肺癌之疾传变的重要因素。中医认为，肺为娇脏，喜润恶燥，邪毒蕴肺，极易耗伤肺气，灼伤肺阴，同时，肺癌患者常因手术、放疗、化疗及疾病本身的发展和恶化，严重耗竭人体的气血津液，故肺极易出现阴虚因素的证候。气阴亏虚贯穿肺癌发病始终，益气养阴是中医药治疗肺癌之本，也是目前的主要治法。

因此，中药扶正散瘤应贯穿肺癌治疗的始终。扶正以益气养阴为主，兼以补虚；散瘤以清热解毒兼以活血化瘀。南通市中医院肿瘤科自创济生散用于肺癌治疗，临床疗效良好[3]，但其作用机制及影响因素有待进一步研究。

本研究以此济生散方煎剂用于细胞学试验观察，发现BEAS-2B 细胞在作用浓度＜2 μL，时间＜8 h时，细胞活力有所上升，这可能是由于本方所用药物多是天然药物，且有温补功效，促进了细胞的活力；当作用浓度＞15 μL，时间延至48 h 时，细胞活力下降，这是因为剂量超过一定的限度，产生了毒副作用，引起细胞死亡。A549 细胞在济生散2 μL 刺激4 h 后，细胞活力会有所下降；H1975 细胞在济生散2 μL 刺激2 h 后，细胞活力下降。两种细胞产生效果的作用浓度和时间略有不同，但均可在低浓度和短时间内产生效果。最终确定选用2 μL 刺激8 h，对BEAS-2B 细胞无影响，但显著影响A549、H1975细胞的活力。细胞形态一定程度上也可反映细胞的状态，A549、H1975 济生散组细胞80%以上皱缩变圆，且贴壁不牢，说明济生散可显著影响A549 和H1975 的活力。

细胞增殖、周期和凋亡是细胞生命活动的基本过程，受到精准而复杂的调控。肿瘤正是由于细胞周期失控所引起的[6]，正常细胞只在受到生长刺激信号或促分裂信号时才进行增殖，肿瘤细胞则是周期紊乱导致细胞增殖过多和凋亡过少。细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖及遗传的基础。细胞凋亡则是生物体细胞主动消亡的过程，是维持机体平衡的关键。济生散可以帮助机体恢复自我调节能力，调整体内系统平衡。BEAS-2B 细胞在济生散作用后，增殖、周期和凋亡无明显变化，说明济生散在该浓度时间作用下，对正常细胞无显著影响。G1期是为DNA 复制做好物质和能量的准备，S 期是DNA 合成期，G2期合成RNA 和蛋白质。A549、H1975 细胞经济生散处理后，G1期细胞显著下降，物质和能量准备不足；S期、G2期细胞显著上升，阻滞于S、G2期，不能进行下一次的细胞分裂，减少细胞的增殖，导致细胞衰老死亡，从而抑制A549、H1975 细胞的生长。本研究亦发现济生散处理后A549、H1975 细胞活力显著下降，而凋亡水平显著上升，这与周期结果一致。提示济生散对肺癌生长有良好的抑制作用，在临床上具有较好的应用前景。但济生散是如何抑制细胞增殖促进细胞凋亡，能否影响及如何影响A549 和H1975细胞的迁移和侵袭等功能，还有待进一步研究。