马甲子对LPS 刺激下人牙髓细胞炎性因子表达影响的初探*

郭方亮，李向芬，邢桂琪，郭林溪，苏 勤

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心 四川大学华西口腔医(学)院牙体牙髓病科，成都 610041

马甲子（Paliurus ramosissimus（Lour.）Poir.）的叶，又名铜钱树、铁篱笆，是鼠李科马甲子属植物。据《中药大辞典》、《中华本草》记载，具有清热解毒、祛风利湿、消肿止痛、散淤止血和治疗痈疮溃疡等功效。在其95%乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物中，主要活性成分为三萜类、生物碱类（环肽）以及黄酮类等，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等活性[1]。余悦等[2]将马甲子乙酸乙酯提取物用于小鼠溃疡性结肠炎模型，发现该提取物能显著降低血清TNF-α 水平，从而达到良好抗炎的效果，提示中药马甲子提取物具有较明显抗炎作用。台湾民间偏方中认为，马甲子可用于治疗急性牙痛；但马甲子能否用于早期牙髓炎症的控制、促进牙髓组织自愈能力，目前尚无相关研究报道。在牙髓炎症中，IL-1β、IL-6 和TNFα 是在其病理过程中常见的且极为重要的炎性细胞因子。本研究拟培养炎症状态牙髓细胞，研究马甲子提取物对体外牙髓细胞的炎症抑制作用，为其作为牙髓治疗的药材的可行性提供基础支持，也为其在口腔其他领域中的应用提供一定的参考。

1 材料和方法

1.1 实验药物

马甲子乙酸乙酯提取物及乙醇提取物由四川省中医药科学院提供（批号：20170823），植株采自四川省成都市牧马山，经四川省中医药科学院舒光明研究员鉴定确认。

马甲子乙醇提取物得率为7.43%，马甲子乙酸乙酯提取物的得率为20.04%。马甲子提取物溶液配制过程如下：①马甲子提取物（乙醇提取物、乙酸乙酯提取物）、DMSO 溶液（二甲基亚砜）、细胞培养液，根据实验需要的用量，按照250 μg∶10 μL∶1 mL 的比例分别称量取出。②在离心管中，将马甲子提取物与DMSO 溶液按照250 μg∶10 μL 混合，振荡器振荡6 min，马甲子提取物溶解于DMSO 溶液中。③在上步所得溶液中加入按照马甲子提取物、DMSO 溶液、细胞培养液为250 μg∶10 μL∶1 mL 的比例的细胞培养液，振荡20 min，使管内各组分溶解。④无菌超净台下使用细菌微孔滤膜（0.22 μm）过滤所得溶液，即得到无菌的马甲子提取物的细胞培养液，其浓度为250μg·mL-1，并稀释为125、62.5μg·mL-1备用，于4℃冰箱中保存备用。

1.2 细胞株

人牙髓细胞（human dental pulp cells，HDPCs），收集自四川大学华西口腔医院外科门诊。

1.3 试剂

CCK-8 细胞计数试剂盒（同仁，日本）；RNA 逆转录试剂盒、SYBR qPCR Mix 试剂盒（Takara，日本）；人IL-1β、IL-6 和TNF-α ELISA 试剂盒（R&D，美国）；炎症细胞炎症合成引物（Sangon Biotech，上海）；牙龈卟啉单胞菌脂多糖（P.g-LPS，InvivoGen，法国）；细胞培养试剂和消耗材料产自Gibco、Hyclone 和Corning 公司。

1.4 主要仪器

荧光实时定量PCR 仪、超微量核酸蛋白测定仪Scandrop100（Analytikjena，德国）；多功能酶标仪（Thermo，美国）。

1.5 方法

1.5.1 细胞收集与培养 经患者知情同意后，取材于本院牙槽外科门诊拔除的符合收集牙髓组织标准的年轻第三磨牙，以改良组织块法培养牙髓原代细胞，经流式细胞术的方法鉴定所得细胞为人牙髓细胞[3]。配制含10%胎牛血清、1%青霉素链霉素双抗溶液的DMEM 培养基，在5%CO2和37 ℃条件下培养，每隔2 天更换一次培养基,待细胞融合度达80%时，用胰蛋白酶（0.25%）消化法以1∶3 或1∶4 传代。在倒置光学显微镜下观察细胞形态，判断细胞状态。

1.5.2 形成体外人牙髓细胞炎症状态 取培养所得的P4 或P5 代HDPCs 按1×106个/mL 接种于6 cm 培养皿上，空白对照组为不加入P.g-LPS，实验组分别为加入1 μg·mL-1P.g-LPS 后刺激HDPCs 3、6、12、24、48h。提取各组样本总RNA 进行逆转录反应，取各组复孔数为3 进行IL-1β、IL-6、TNF-α 的RT-PCR 实验，引物序列根据Genebank 中的IL-1β、IL-6、TNF-α以及GAPDH 基因序列设计，委托上海生工生物工程公司合成，具体序列见表1。

表1 IL-1β、IL-6 和TNF-α 基因序列设计

RT-PCR 反应条件：50℃下2min，95℃下10min；95 ℃下30 sec 与60 ℃下30 sec；共40 循 环。以GAPDH 为内参，最终数据以2-△△Ct方法进行分析，通过炎症相关细胞因子的mRNA 表达水平结果，确定形成炎症状态的体外HDPCs 最佳的P.g-LPS 刺激的时间。

1.5.3 马甲子提取物对HDPCs 生长的影响 取培养所得的P4 或P5 代HDPCs，按1×106个/mL 接种于96 孔板，空白对照组为正常培养的HDPCs；实验组为培养所得HDPCs 中分别加入1%DMSO 及250、125、62.5 μg·mL-1马甲子提取物溶液（组名分别为DMSO 组；250 μg·mL-1乙醇提取物、250 μg·mL-1乙酸乙酯提取物；125 μg·mL-1乙醇提取物、125 μg·mL-1乙酸乙酯提取物；62.5 μg·mL-1乙醇提取物、62.5 μg·mL-1乙酸乙酯提取物）。各组取复孔数为3。分别于1、2、3、4、5 d 采用CCK-8 实验方法获取各时间点的各组所测得OD 值（A），计算各组细胞活力相对值=（A计算孔-A空白孔）/（A对照第一天-A空白孔），绘制从1 天到5 天的各组HDPCs 的生长曲线，以确定保证HDPCs 生长的最佳的马甲子提取物浓度。

1.5.4 马甲子提取物对HDPCs 的炎性因子表达的影响 选取生长状态良好的P4 或P5 代的HDPCs，以每孔2×105个的密度接种于6 孔板，空白组（LPS-）：正常培养HDPCs；对照组（LPS+）：加入1μg·mL-1P.g-LPS 的HDPCs；溶剂组（DMSO）：加入1%DMSO 与1 μg·mL-1P.g-LPS 的HDPCs；实验组（乙醇提取物、乙酸乙酯提取物）：加入125 μg·mL-1马甲子乙醇或乙酸乙酯提取物，1 μg·mL-1P.g-LPS 的HDPCs。各组复孔数为3。各组在培养时间结束后分别收集总分泌蛋白，采用ELISA 的实验方法对各组HDPCs 的IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白的分泌表达进行检测；同时完成总RNA 提取、逆转录反应、RTPCR 反应，检测各组HDPCs 的IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA 表达。

1.6 统计学处理

用SPSS 20.0 软件对结果进行统计学分析，采用ANOVA 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态学观察

如图1 和图2 所示：通过镜下观察，在收集原代细胞后第4～7 天，有细胞从组织块边缘爬出，细胞形态无统一，排列多杂乱无序。经培养一段时间至P2 代后，细胞变得均匀一致，多为梭形和多角形，胞质丰富，核位于中央，核仁清晰，形态似成纤维细胞，可用于后续实验。

图1 原代细胞（40×）

图2 P2 代细胞（40×）

2.2 P.g-LPS 刺激不同时间HDPCs 的炎症相关因子mRNA 水平的表达情况

由表2 可见，使用P.g-LPS 刺激HDPCs 3 h，能够显著诱导IL-1β，IL-6 及TNF-α 炎症相关细胞因子基因mRNA 的表达，并且表达水平呈高峰期，即本刺激条件能成功使体外牙髓细胞进入炎症状态，可用于后续马甲子提取物抗炎性能的实验研究。

表2 P.g-LPS 刺激不同时间HDPCs 炎症相关因子mRNA 表达情况

2.3 不同浓度梯度的马甲子提取物培养HDPCs的细胞生长曲线

通过测量各分组在各时间点的吸光度，计算各组细胞活力相对值所绘制的各组5 天内的HDPCs生长曲线由图3 可见，1%DMSO 对细胞生长曲线无明显影响；125 μg·mL-1和62.5 μg·mL-1浓度的马甲子提取物能保证细胞处于较好的生长增殖状态，因此选用浓度相对较高的125 μg·mL-1进行后续实验。

图3 （A）马甲子乙醇提取物和（B）马甲子乙酸乙酯提取物不同浓度梯度用于培养HDPCs 的细胞生长曲线（n=5）

2.4 马甲子提取物对炎症环境下HDPCs 的炎性相关细胞因子蛋白及mRNA 表达的影响

由图4 可见，马甲子乙醇提取物和马甲子乙酸乙酯提取物能下调在P.g-LPS 刺激下的HDPCs 的IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA 的表达，也能抑制P.g-LPS 刺激下的HDPCs 分泌的IL-1β、IL-6 和TNF-α 蛋白。两种提取物对炎症因子mRNA 和蛋白的表达影响无明显差异。1% DMSO 溶剂对炎症HDPCs 的相关炎症细胞因子的表达和分泌无显著影响。

图4 炎症环境下各组HDPCs 的炎性相关细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白（A、B、C）及mRNA（D、E、F）表达量（n=3）

3 讨论

牙髓组织具有一定的自身修复能力，如何消除早期或局限的炎症牙髓组织中的感染物、保存健康牙髓、维护牙髓正常生理功能是临床诊治该类疾病的首要目的。随着微创牙科理念的发展，新材料和新技术的应用，如何精准合理应用各种治疗技术和材料，最大限度地获得损伤牙髓部分活髓保存的良好治疗效果，延长患牙保存期，实现保髓治疗效果的最大化，已成为口腔临床医生非常关注和迫切需要解决的问题。马甲子的抗炎性能为其作为活髓保存的抗炎药物提供一个新的临床治疗思路。

IL-1β、IL-6 和TNF-α 是常见的炎性因子，因此，本实验中通过检测其mRNA 和蛋白的表达水平来反映牙髓细胞炎症的严重程度[4-6]。LPS 通过与细胞表面TLR 受体结合后，激活多种下游的与炎症反应相关的信号通路，因此以LPS 刺激HDPCs 是较为常用形成炎症状态的牙髓细胞的方法[7]。

马甲子提取物墨绿色粉剂难以直接溶于细胞培养液，为了将马甲子提取物制备为溶液用于细胞实验，以DMSO 作为中间溶剂使其与细胞培养液相溶。二甲基亚砜（DMSO）具有良好的热稳定性，能与水及大多数的有机物相溶，是一种公认的“通用溶剂”，且有研究认为，在4%及更低浓度的DMSO 溶液中，细胞的生长和增殖不受影响[8]。同时，实验中也通过设置DMSO 的溶剂组消除了DMSO 可能对结果造成的偏倚。

通过实验检测了马甲子提取物对炎症状态的HDPCs 的炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA水平和蛋白水平表达的影响，确定马甲子提取物能显著抑制其炎性因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表达，提示马甲子提取物能对牙髓炎症反应产生一定抑制作用。该结果为马甲子用于口腔临床相关炎症的治疗提供了一定的基础支持；但其在牙髓细胞中的抗炎的机理有待进一步的研究。