LC-MS/MS 法测定人血浆中的非洛地平浓度

许 珩，洪富美，*，赵 莉

1 徐州医科大学，徐州 221004;2 徐州立新佳正医药科技有限公司，徐州 221100

非洛地平（felodipine）是一种对血管具有高选择性的二氢吡啶类钙离子拮抗剂，主要抑制小动脉平滑肌细胞外钙离子的内流，选择性扩张小动脉，又因其对静脉平滑肌和肾上腺素血管张力调节无影响，故不引起体位性低血压；适用于各型高血压、缺血性心脏病及心力衰竭的治疗[1，2]。临床应用广泛；但非洛地平会引起严重性低血压和心动过缓，故对老年患者采取治疗药物监测，尤为重要。

由于非洛地平给药剂量小，血药浓度低且遇光不稳定，常规测定方法难以满足人体药动学研究的需要。在现有文献中，大多采用液液萃取法或固相萃取法。余鹏[2]等采用乙醚-正己烷（1∶1，v∶v）对血浆样本进行萃取，毒性较大，血浆使用量多，步骤繁琐，成本高昂；吴正宇[3]等使用固相萃取板对血浆样本进行萃取，但检测缺点并未改观。

本研究采用高效液相色谱-质谱法测定人血浆中非洛地平浓度，生物样本前处理简单快捷、回收率较好、无明显基质效应、分析时间较短仅为3.5 min，有利于制备大量样本并进行高通量分析，从而缩短研究时间，节约成本，提高经济效益，适用于非洛地平的临床血药浓度检测及生物等效性实验。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

ExionLCTM 高效液相色谱，TRIPLE QUADTM6500+三重四级杆串联质谱仪（均美国AB SCIEX公司）；MSA6.6S-0CE-DM 百万分之一天平（德国Sartorius 公司）。

1.2 药品与试剂

非洛地平对照品（纯度：99.6%，批号：100717-201403，中国食品药品检定研究院，校正因子：0.99600）；非洛地平-d3内标[纯度：96%（化学纯）、99.9%（同位素纯度）、99.83%（归一化强度），校正因子：96%×99.9%×99.83%=0.95741），批号：4-RFS-1-1,加拿大Toronto Research Chemicals]；乙腈、醋酸铵均为HPLC 纯度（美国J.T.Baker）；甲酸为ACS纯度；水为超纯水。

2 方 法

由于非洛地平在光照下不稳定，易降解，所以本实验过程中注意避光。采用双标准曲线进行定量分析，每个分析批制备两条标准曲线。

2.1 检测条件

色谱条件：色谱柱为Waters Xbridge-C18（2.1mm×50 mm，3.5 μm）；流动相A 为水/甲酸/1 mol·L-1醋酸铵（100/0.2/0.1，v/v/v），流动相B 为乙腈/甲酸/1 mol·L-1醋酸铵（100/0.2/0.1，v/v/v），梯度洗脱，程序见表1；流速：0.4 mL·min-1；柱温：40 ℃，进样体积：20 μL。分析时间为3.5 min。

表1 梯度洗脱程序

质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI），以质谱多重反应监测（MRM）方式进行正离子检测，检测离子分别为m/z 384.2→352.0（非洛地平），m/z 387.2→351.9（非洛地平-d3）。质谱检测器的主要参数：气帘气（CUR）207 kPa、碰撞气（CAD）55 kPa，电离子喷雾气压（IS）5500 V，温度400 ℃，离子源气体1103 kPa，离子源气体1655 kPa，非洛地平和非洛地平-d3的离子去簇电压（DP）均为35 V，入口电压（EP）均为12 V，碰撞活化电压（CE）均为19 V，碰撞室出口电压（CXP）均为11 V。

数据的采集和处理均使用Analyst 1.6.3 软件。

2.2 溶液的配制

精密称取非洛地平对照品及非洛地平-d3内标适量，用乙腈/水（50/50，v/v）分别配制成浓度为100 ng·μL-1的储备液，置于4 ℃冰箱备用。用乙腈/水（50/50，v/v）稀释储备液配制成不同浓度的非洛地平工作溶液以及0.08 ng·μL-1内标工作溶液。

2.3 血浆样品预处理

精密吸取血浆样品200 μL 于96 深孔板中，添加0.08 ng·μL-1内标溶液10 μL 至每一样本，空白及残留样本添加10 μL 的乙腈/水（50/50，v/v）。混匀后加入乙腈800μL，20℃下以4000r·min-1离心10min，转移700 μL 上清液至另一96 深孔板中，于纯净氮气流下，40°C 蒸发干燥，固体物中加入250 μL 乙腈/水/甲酸/1 mol·L-1醋酸铵（55/45/0.2/0.1，v/v/v/v）复溶，进样20 μL，进行LC-MS/MS 分析。

2.4 标准血浆样本及质控样本的配制

在1.5 mL EP 管中，分别加入570 μL 空白血浆与30 μL 相应浓度非洛地平的标准曲线用工作溶液或质控用工作溶液，涡旋混匀即可得到0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1、3.2、4 ng·mL-1浓度的标准血浆样本及0.02、0.06、0.35、2、3 ng·mL-1浓度的质控样本。

另配制空白样本、残留样本及零浓度样本各600 μL。按“2.3”项预处理，残留样本为未添加分析物与内标的空白样本，按样本步骤制备后，接续于每一个分析批的校正标样ULOQ 后分析，以评估残留效应。

3 方法学验证及结果

3.1 选择性测试

选取6 个不同来源的空白血浆样本以及3 个不同来源的空白溶血血浆样本，并分别按“2.4”项下配制标准血浆样品，以评价空白血浆对分析物及内标的干扰；另制备定量上限样本（ULOQ）于空白样本（无内标），以评价分析物对内标的干扰。同时，利用该分析批的零浓度样本，进行内标对分析物的干扰评估。按“2.3”项下方法处理，按“2.1”检测条件进样分析，并记录色谱图。在符合非洛地平保留时间处的干扰峰响应均低于该分析批的标准曲线中定量下限样本（LLOQ）的非洛地平响应的20.0%；在符合内标保留时间处的干扰峰响应均低于该分析批的标准曲线中定量下限样本的内标响应的5.0%，见图1。

图1 典型血浆样品色谱图

非洛地平和非洛地平-d3的保留时间（RT）分别在1.415 min 左右和1.417 min 左右，峰形良好，血浆中的内源性物质不干扰本品及其内标的测定。

3.2 提取回收率和基质效应

按“2.4” 方法配制0.06、2、3 ng·mL-1（QL、QM、QH）3 个浓度的对照品血浆样品，QL 为3 倍的标准曲线定量下限（LLOQ）浓度，QM 为标准曲线定量上限（ULOQ）的50%，QH 为标准曲线定量上限（ULOQ）的75%。每个浓度平行3 个样本，按“2.3”项下方法处理，即为制备后样本。取空白血浆200 μL，按“2.3”项下从“空白及残留样本添加10 μL 的乙腈/水（50/50，v/v）”开始操作，即为非制备后样本，非制备后样本共三个浓度，每个浓度制备3 个平行样本。选择6 种不同来源的空白人血浆，操作同非制备后样本，即为基质效应测试样本，每个浓度制备6个平行样本（每个来源1 个）。配制低、中、高3 种浓度的分析物复溶液（分析物浓度分别为0.0336、1.12、1.68 ng·mL-1，内标为2.24 ng·mL-1，溶液中分析物与内标浓度按QL、OM、QH 上机浓度进行回算），用以复溶非制备后样本、基质效应测试样本、不含生物基质的样本(以纯水为基质)。不含生物基质的样本操作同基质效应测试样本，每个浓度1 个样本，每个样本分析6 次。复溶后三者的上机浓度与QL、QM、QH 相同。计算提取回收率（制备后样本的平均响应值/非制备后样本的平均响应值）与内标归一化基质因子（分析物基质因子=含基质的分析物样本响应/不含基质的分析物样本响应平均值，内标基质因子=含基质的内标样本响应/不含基质的内标样本响应平均值，内标归一化基质因子=分析物基质因子/内标基质因子），计算结果见表2。

表2 准确度、精密度、提取回收率与基质效应的测定结果

对此表明，分析物和内标的提取回收率达到预定标准，非洛地平无明显空白血浆基质效应，不影响分析物的定量分析。

3.3 标准曲线与最低定量限（LLOQ）

按“2.4”项方法配制8 个浓度级别的系列标准血浆样品，按“2.3”项方法处理并进行分析，记录非洛地平与非洛地平-d3的色谱峰面积。共制备分析批10 个，每个分析批含2 条标准曲线，一共20 条标准曲线。以分析物（非洛地平）与内标（非洛地平-d3）的色谱峰面积比值（Y）为纵坐标，血浆中分析物的浓度（X）进行线性回归，加权为1/X2，得到非洛地平的线性回归方程：Y=0.267X-8.01×10-5（r=0.998 9），结果表明非洛地平在0.02～4 ng·mL-1与峰面积线性关系良好，最低定量限为0.019 62 ng·mL-1（准确度在80%～120%，精密度RSD＜20%）。

3.4 准确度与精密度试验

按“2.4”项方法配制0.02、0.06、0.35、2、3 ng·mL-15 种不同浓度的质控样本，每个浓度至少进行6 个样品分析，共测定3 个分析批，按“2.3”项下方法处理，非洛地平的批内、批间准确度和精密度结果见表2。结果表明，5 种不同浓度的批内、批间准确度和精密度偏差均小于15%，符合生物样本测试的要求。

3.5 稳定性考察

按“2.4”项方法配制0.06、3 ng·mL-12 种浓度含药血浆样品，每一浓度平行3 个样本。样本在室温放置52 h 后处理，测定浓度，测定值与0 h 的平均偏差分别为11.2%、4.5%；处理样本后于自动进样器（15℃）中放置59 h，测定值与0 h 的平均偏差分别为9.7%、3.1%；处理样本后于4 ℃冰箱中放置50 h，测定值与0 h 的平均偏差分别为9.5%、4.6%。于-20 ℃下冻融样本5 次后，无辅助解冻，测定值与0 h 的平均偏差分别为6.5%、5.9%，水浴解冻，测定值与0 h的平均偏差分别为3.3%、5.6%；于-80 ℃下冻融样本5 次后，无辅助解冻，测定值与0 h 的平均偏差分别为4.7%、3.3%，水浴解冻，测定值与0 h 的平均偏差分别为-1.2%、1.1%。在-20℃冰箱储存样本32 d后，测定值与0 h 的平均偏差分别为-0.1%、1.0%；在-80 ℃冰箱储存样本32 d 后，测定值与0 h 的平均偏差分别为0.4%、-3.2%。结果表明，非洛地平在各考察条件下均具有良好的稳定性。

3.6 残留效应

在每个分析批最高浓度的校正标样（ULOQ）后面进样空白样本作为残留测试样本。残留测试样本在分析物保留时间处的干扰峰的响应均低于该标准曲线中定量下限样本中非洛地平响应的20.0%，内标保留时间处的干扰峰的响应均低于定量下限样本中内标响应的5.0%。结果表明，该方法残留可忽略不计，不影响定量分析。

3.7 方法应用

本试验经过常州市第二人民医院医学研究伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。12 位受试者随机分为两组，均在空腹状态下单次口服5 mg非洛地平缓释片受试制剂和参比制剂。第一个周期，第一组给予受试制剂，第二组给予参比制剂。经过7 天的清洗期后，进行交叉互换。第二周期，第一组给予参比制剂，第二组给予受试制剂。测定其服药前（0 h）及服药后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8、9、10、12、24、36、48 h 的非洛地平血药浓度，受试制剂与参比制剂的Cmax分别为（1.56±1.15）ng·mL-1、（1.39±1.09）ng·mL-1，药-时曲线吸收、分布、消除形态基本完整，见图2。

图2 受试者口服受试、参比制剂血浆中非洛地平的药-时曲线

4 讨论

非洛地平具有光不稳定性，在溶液和血浆样本中经室内日光灯照射10 min 后降解率即超过15%[4]，应选用避光的储备容器，并在避光条件下进行实验。

本实验采用LC-MS/MS 法，具有色谱分离与质谱分离的双重功能，依靠质谱的分辨能力区分不同物质的色谱峰，抗干扰能力强。本实验采用蛋白质沉淀法进行生物样本前处理，操作简单快捷且定量下限更低，为0.01962 ng·mL-1；但提取回收率与基质效应结果、批内、批间准确度与精密度尚存在不足。本实验方法应用样本量较少，结果存在个体差异，后续需扩大样本量。非洛地平临床应用剂量小，血药浓度极低，对分析方法的稳定性要求较高，在优化色谱过程中，选用Waters Xbridge-C18（2.1 mm×50 mm，3.5 μm）色谱柱，可以获得较好的峰形及较佳的保留时间，空白基质背景较低，可以较好地分离分析物和排除杂质干扰。本实验考察了甲酸和醋酸铵对色谱行为的影响，结果发现，甲酸的加入为非洛地平提供了对称峰形，添加醋酸铵增强了对分析物的保留。本方法每个分析批制备两条标准曲线使定量更加准确。采用稳定同位素内标，其与待测物分子性质一致，可最大限度地消除分析方法的误差，干扰小、定量结果准确、稳定、变异性小。在文献[3，4]中，分析时间均大于5 min，本实验分析时间仅为3.5 min，缩短了样本的分析周期，有利于大样本待测物的分析，提高工作效率，节约成本，能满足非洛地平缓释片的人体药动学及生物等效性的研究。