肿瘤相关抗原MAGE-D4在肝细胞癌中的表达及其意义

罗 鑫， 沈 宁， 刘 畅， 张 沅， 林丽娜， 李 枫， 李冰滢， 肖绍文， 陈 芳， 张庆梅

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占原发性肝癌的70%～90%[1]，具有恶性程度高、发病隐匿、侵袭性强、预后差和生存率低等特点[2]，急需探索新的HCC治疗方法。近年来，肿瘤免疫治疗因其较好的特异性和较小的副作用而备受关注[3]，但肿瘤免疫治疗需要筛选肿瘤特异性抗原。黑色素瘤相关抗原(melanoma-associated antigen,MAGE)是一个多基因的大家族，因其第一个成员首先在黑色素瘤中发现而得名，可分为A、B、C、D、E、F等亚家族，其许多成员在多种肿瘤类型中呈特异性高表达，被视为肿瘤免疫治疗的理想靶点[4]。MAGE-D4是2001年Sasaki等[5]发现的一个MAGE家族成员，与其他许多成员一样，其基因定位于X染色体，具有MAGE家族共有的同源结构域(MAGE homology domain,MHD)。有研究报道MAGE-D4在胶质瘤、脑膜瘤、结直肠癌和口腔癌等多种恶性肿瘤中呈高表达[6-11]，而在正常组织中不表达或低表达[5，8]，提示MAGE-D4具有肿瘤特异性，具有进一步开发成肿瘤免疫治疗靶点的潜力。本研究应用在线数据库结合实验验证，分析HCC中MAGE-D4 mRNA和蛋白质的表达水平及其与患者临床病理参数的关系，并探讨其表达水平与生存预后的关联性，初步评价MAGE-D4作为HCC潜在治疗靶点和预后标志物的潜在价值。

1 材料与方法

1.1数据获取及分析 通过癌症基因组图谱(the Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库(https://cancergenome.nih.gov/)获取371例HCC组织和50例正常肝组织的转录数据。应用数据挖掘工具UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/)分析HCC组织中MAGE-D4 mRNA的表达，mRNA表达水平以每千个碱基的转录每百万映射读取的抄本数(transcripts per kilobase of exon model per million mapped reads,TPM)表示。通过对TCGA数据库中的基因转录本数据进行预处理，以尽可能多地获取各种不同基因的RNA水平表达数据，最终获得共56 953个基因的RNA表达数据。应用Pearson相关性分析，从这些备选基因中筛选与HCC中MAGE-D4表达相关的基因[12]。应用Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)分析MAGE-D4表达与HCC患者生存预后的关联性[13]，并绘制Kaplan-Meier生存曲线图。生存分析以MAGE-D4 mRNA表达水平的上三位数为分界值，将HCC患者分为低表达组和高表达组；另外按患者人种进行分层。

1.2组织标本和临床资料收集 选择于广西医科大学第一附属医院2009年6月至2011年8月经手术获取的HCC标本70例，癌旁组织标本30例。HCC患者中男57例，女13例；年龄24～78(48.5±11.2)岁。按Edmondson病理分级，1级10例，2级40例，3级16例，4级2例，另有2例分级不明确。按TNM分期，Ⅰ期4例，Ⅱ期19例，Ⅲ期38例，Ⅳ期9例。所有组织均经病理科专家确诊。同时，通过医院病历系统收集所有标本来源患者的肿瘤直径、血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)浓度、癌栓和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染等临床资料。以上组织标本和临床、病理资料的收集均获患者知情同意，并经广西医科大学伦理委员会批准(编号：20130310-1)。

1.3免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)染色与结果评判 以10%中性福尔马林固定组织标本，经石蜡包埋制成切片后按常规方法进行MAGE-D4染色。免疫组化染色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，MAGE-D4兔抗人多克隆抗体由本课题组制备[14]。采用已知MAGE-D4表达阳性的胶质瘤组织作为阳性对照，以兔免疫前血清替代一抗作为阴性对照。染色结果以阳性细胞百分比和染色强度相加的方法进行综合评判[15]。阳性细胞百分比积分：0%～5%计0分，6%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分。染色强度积分：无染色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。将二者积分相加，0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)。其中(-)和(+)归为低表达组，而(++)和(+++)归为高表达组。

2 结果

2.1HCC组织与正常肝组织的MAGE-D4 mRNA表达水平比较 对来自TCGA数据库的数据进行比较分析，结果显示，HCC组织MAGE-D4 mRNA的表达水平显著高于正常肝组织(P<0.001)。见图1。

图1 HCC组织与正常肝组织的MAGE-D4 mRNA表达水平比较结果图

2.2HCC组织中MAGE-D4 mRNA表达相关基因的筛选结果 基于TCGA数据库数据，采用Pearson相关性分析探讨HCC组织中与MAGE-D4 mRNA表达具有相关性的其他基因，结果显示MAGE-D4与AFP的相关性最高(r=0.556)。与MAGE-D4 mRNA表达呈正相关或负相关的前10个基因见表1。

表1 HCC组织中MAGE-D4 mRNA表达相关基因的筛选结果

2.3MAGE-D4 mRNA表达水平与患者生存预后的关联性分析结果 黄种人患者，MAGE-D4 mRNA低表达组的5年生存率为69.8%，高表达组的5年生存率为48.8%，低表达组的生存预后显著优于高表达组(P<0.05)。白种人患者，MAGE-D4 mRNA低表达组的5年生存率为36.6%，高表达组的5年生存率为45.2%，两组生存预后差异无统计学意义(P>0.05)。由于收集到黑种人HCC患者例数较少(n=28)故未能单独进行生存分析。对全种族人群(黄种人、白种人和黑种人)HCC患者进行生存分析，结果显示，MAGE-D4 mRNA低表达组的5年生存率为48.4%，高表达组的5年生存率为47.3%，两组生存预后差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

ⓐ全种族人群(n=364)；ⓑ黄种人(n=155)；ⓒ白种人(n=181)

2.4HCC组织与癌旁组织MAGE-D4蛋白表达情况比较 MAGE-D4蛋白主要定位于细胞质和细胞核，染色程度深浅不一，呈淡黄至棕褐色均质或颗粒状分布。在70例HCC组织中，有34例(48.57%)为MAGE-D4高表达，36例(51.43%)为低表达；在30例癌旁组织中，有7例(23.33%)为MAGE-D4高表达，23例(76.67%)为低表达，两组高表达率比较差异有统计学意义(χ2=5.530，P=0.019)。见图3。

A1：HCC组织，MAGE-D4(+)；A2：癌旁组织，MAGE-D4(-)；B1：HCC组织，MAGE-D4(+++)；B2：癌旁组织，MAGE-D4(-)；A1与A2为来源于同一患者的HCC组织和癌旁组织；B1与B2为来源于同一患者的HCC组织和癌旁组织

2.5MAGE-D4蛋白表达水平与HCC患者临床病理参数的关联性分析结果 MAGE-D4蛋白高表达组34例，低表达组36例。高表达组HCC患者血清AFP浓度≥400 μg/L的人数比例显著大于低表达组(P<0.05)，但两组性别、年龄、肿瘤级别、肿瘤分期、肿瘤直径、癌栓和HBV感染情况比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 MAGE-D4蛋白表达水平与HCC患者临床病理参数的关联性分析结果

续表2

3 讨论

3.1HCC是全球第六大常见的恶性肿瘤和第二大肿瘤致死原因，每年新增发病例约80万例[16]。我国是HCC高发地区，发病人数占全世界的50%以上，发病率和病死率在所有肿瘤类型中分别排第四位和第三位[17-18]。HCC的危险因素包括HBV和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)慢性感染、酒精性肝炎以及脂肪性肝炎等[19]。目前，HCC的早期治疗以手术切除和射频消融为主，而中晚期则使用局部治疗联合系统治疗，但治疗效果不理想，中位生存时间和无进展生存期仍不能让人满意[20-21]。

3.2免疫治疗是近年来兴起的一种具有广阔临床应用前景的肿瘤治疗策略，其通过增强机体对肿瘤特异性免疫、打破免疫耐受，达到抑制肿瘤进展的目的，目前主要有肿瘤疫苗、过继细胞转移(adoptive cell transfer,ACT)疗法和免疫检查点抑制剂三条治疗路线，但由于肿瘤特异性抗原的缺乏限制了其开发与应用。目前HCC的免疫治疗，如细胞程序性死亡-配体1(programmed death-ligand 1，PD-L1)抗体等取得了一定进展，更多的HCC免疫治疗靶点有待发现和进一步验证[3]。

3.3由于MAGE家族的许多成员具有肿瘤特异性，因此其具有成为肿瘤免疫治疗靶点的潜质，近年已有一些家族成员，如MAGE-A1和MAGE-A3已作为疫苗靶点进入临床试验[22-23]。MAGE家族成员MAGE-D4不仅具有肿瘤特异性[5-11]，近年来也有研究证实其具有较强的免疫原性，可引起机体强烈的体液免疫和细胞免疫应答，在以MAGE-D4抗原为基础的肿瘤疫苗研究中也初步展现出一定的效果[9，24-27]。因此，MAGE-D4有进一步开发成肿瘤免疫治疗靶点的潜力，应用前景广阔。但迄今为止，学者们对MAGE-D4与HCC的关联性研究仍较少[11]，本文就此进行了研究。本研究结果显示，HCC组织中MAGE-D4 mRNA的表达水平显著高于正常肝组织，这与Takami等[11]的研究报道相似。另外，进一步的IHC法检测结果也显示，HCC组织中MAGE-D4蛋白呈高表达。

3.4蛋白的定位与其在组织细胞中所发挥的生物学功能密切相关。Ito等[15]报道MAGE-D4与细胞骨架微丝共定位于细胞质，在有丝分裂末期至后期，MAGE-D4蛋白与微管蛋白共定位于纺锤体和中心体，提示MAGE-D4可能参与了细胞分裂活动。而Chong等[28]报道MAGE-D4蛋白主要定位于口腔鳞状上皮癌的癌细胞质，偶见于细胞膜。本研究结果显示，HCC中MAGE-D4蛋白主要定位于细胞质和细胞核，这和Takami等[11]的报道有异同，相同之处在于均发现HCC细胞质中存在MAGE-D4蛋白，而不同之处在于其并未在HCC细胞核中检测到MAGE-D4蛋白，但发现HCC细胞膜中存在MAGE-D4蛋白，造成这种不一致的原因可能与不同的肿瘤标本和肿瘤的异质性表达等因素有关。此外，MAGE-D4蛋白在肿瘤细胞分布的多样化可能与其在不同肿瘤细胞中发挥不同功能有关。MAGE-D4在HCC中发挥的确切生物学功能，有待进一步的研究。

3.5AFP与HCC的发生、发展密切相关，其在HCC的辅助诊断及疗效监测中具有重要价值[29-30]。基于TCGA数据库分析结果显示，AFP与MAGE-D4的相关性最高，呈正相关(r=0.556,P=0.000)，这在本课题组收集的临床标本中也得到进一步验证，与Takami等[11]的研究结果相似。提示MAGE-D4在HCC中可能与AFP协同参与了HCC的发生和进展。另外，本研究基于TCGA数据库数据进行生存分析，结果显示对于总体HCC患者，MAGE-D4 mRNA的表达水平与生存预后关联性不显著，但经进一步分层分析结果显示，MAGE-D4 mRNA高表达与黄种人HCC患者不良预后有关，但与白种人HCC患者生存预后不显著。这提示MAGE-D4 mRNA表达对HCC患者生存预后的影响可能具有人种差异，其对于黄种人更具临床价值和意义。

综上所述，MAGE-D4具有成为HCC免疫治疗靶点和预后标志物的潜力，但其在HCC发生、发展中所发挥作用的机制尚不清楚，需进一步深入研究。