叶酸水平与心脑血管疾病终点事件的关联性及性别差异研究

杨志康， 木拉力别克·黑扎提， 王 林， 李 梅， 王中蓉， 热依拉·阿不都热依木，吴自豪， 潘凤瑜， 洪 静， 李南方

心脑血管疾病(cardio-cerebrovascular disease,CVD)是世界范围内造成死亡的首要病因，据世界卫生组织报告[1]，全球每年约有30%的死亡事件与CVD相关，其中大部分出现在发展中国家。我国作为最大的发展中国家，承担着较重的CVD防控负担[2]。高血压、糖尿病、抽烟、肥胖、体育运动等危险因素与CVD之间的关联性已得到广泛证实，而机体叶酸水平与CVD之间的关系近年来也受到研究者的关注。有研究[3-5]提出叶酸缺乏会增加CVD的发生风险，但研究结论尚不一致。与西方发达国家不同，我国未施行全民叶酸补充计划，这使得我国约有40%的北方人口及6%的南方人口存在叶酸缺乏(<3 ng/ml)的情况，而其中又以新疆人群叶酸缺乏情况较为严重[6]。鉴此，本研究以新疆人群作为研究对象探讨叶酸水平与CVD发生的关联性，以期为该地区的CVD防控提供参考。

1 对象与方法

1.1研究对象 本研究基于2014年1月至2014年12月我中心的一项课题项目基础上开展，通过多级分层随机抽样的方法抽选研究对象[7]：将额敏县分为农区、牧区和城区，并以每个地区的2个镇及所选镇的2个乡作为调查点。纳入标准：(1)年龄≥15岁；(2)在本地居住时间超过6个月的常驻居民；(3)知情同意参与本研究并能配合调查问卷、体格检查及血液标本采集者。排除标准：(1)肾功能不全、恶性贫血、恶性肿瘤患者；(2)孕妇；(3)在过去1个月服用过抗惊厥药物、抗结核药物、避孕药、多巴胺药物及叶酸补充剂者；(4)既往有CVD病史。本研究共有1 926人完成了问卷调查、体格检查及血液样本采集，其中信息完整、叶酸检测合格的1 807人，排除既往有CVD病史的16人，最终纳入1 791名研究对象进行随访。

1.2基线数据采集 (1)人口学基本信息采集，由培训合格的调查员进行面对面问卷调查，包括年龄、性别、民族、受教育水平及疾病史等。(2)体格检查，人体测量学指标由调查员按照标准测量方法获得，包括身高、体重、血压、体质量指数(Body Mass Index,BMI)等。(3)血液指标检测，采集研究对象清晨空腹静脉血3 ml，并在30 min内进行血清分离(3 000 r/min，离心10 min)，储存于-80 ℃超低温冰箱中备用。由新疆维吾尔自治区人民医院检验科完成叶酸(仪器：Beckman-UniCel D×I 800)和同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)(仪器：DIRUI-CS-T300)的检测。

1.3随访 随访开始于2016年1月，最近的一次随访结束于2019年12月，共1 687人完成了随访，失访率约为5.8%。通过现场调查的方式实施随访，为了提高研究对象的主动参与性，随访与当地的年度全民体检地点和时间一致。未能参加现场调查的随访对象则通过电话访问、入户调查、于当地县医院检索住院信息等方式完成随访，同时向家属确认研究对象的存活情况、死亡原因及死亡时间。同时还调查了研究对象的长期药品使用情况。以叶酸水平三分位将研究人群共分为三组：<4.55 ng/ml组(组1，569例)、4.55～6.96 ng/ml组(组2，560例)和>6.96 ng/ml组(组3，558例)。

1.4相关指标定义 (1)CVD终点事件：包括首发的脑血管事件、心绞痛、冠状动脉粥样硬化性心脏病、需要住院治疗的心衰、检查发现的血管狭窄(肾动脉、上下肢动脉及颈动脉)及CVD相关死亡。研究对象需回答“疾病是否被区县及以上级别医院诊断过”“是否有支持诊断的检查报告结果”。为了提升终点事件报告的质量，仅研究对象回答“是”的终点事件被用于分析。(2)抽烟：定义为过去累计吸烟量超过20包香烟，目前正在吸烟。(3)饮酒：定义为在调查的前30 d内的每周至少饮酒1次。

1.5统计学方法 应用SPSS25.0统计软件进行单因素和多因素Cox回归分析。应用网页工具(http://www.dagitty.net)进行基于因果关系的有向无环图(Directed Acyclic Graph,DAG)分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1CVD终点事件的单因素Cox回归分析结果 在随访过程中共有143人发生了CVD终点事件，其中脑卒中和心梗占72.7%(104/143)。单因素Cox回归分析结果显示，年龄、Hcy水平、文化水平、婚姻状态、职业、抽烟、饮酒、合并高血压、合并糖尿病与CVD终点事件的发生存在关联(P<0.05)。见表1。

表1 CVD终点事件的单因素Cox回归分析结果

续表1

2.2基于因果关系的DAG分析结果 通过开发者提供的网页工具(http://www.dagitty.net)分析变量间的因果关系，获得最小充分必要校正集：性别、年龄、BMI、腹型肥胖、民族、文化水平、婚姻状态、职业、抽烟、饮酒、合并高血压及Hcy水平。DAG见图1。

图1 DAG分析结果图

2.3多因素Cox回归分析结果 根据单因素Cox回归分析结果，对年龄、Hcy、文化水平、婚姻状态、职业、抽烟、饮酒、合并高血压、合并糖尿病进行校正，多因素Cox回归分析结果显示，叶酸与CVD终点事件的发生无显著关联(P>0.05)。根据DAG分析结果，对性别、年龄、BMI、腹型肥胖、民族、文化水平、婚姻状态、职业、抽烟、饮酒、合并高血压、Hcy水平进行校正，多因素Cox回归分析结果显示，与组2比较，组1发生CVD终点事件的风险更高(P<0.05)。见表2。

表2 多因素Cox回归分析结果

2.4以性别分层的多因素Cox回归分析结果 对于男性，与组3相比，组1发生CVD终点事件的风险更高(HR=2.57，P=0.007)；其他组间比较风险差异无统计学意义(P>0.05)。对于女性，与组2相比，组1和组3发生CVD终点事件的风险均更高(HR=2.11，P=0.026；HR=1.84，P=0.039)。见表3。

表3 以性别分层的多因素Cox回归分析结果

3 讨论

3.1CVD是危害人类健康的主要病因，当学者们围绕传统危险因素进行激烈讨论时，叶酸缺乏也被认为与先天性神经管缺陷的发生具有关联[8]，而近年的研究也指出其可能增加了CVD的患病及相关死亡的风险，但是目前的研究结果并不一致。本研究结果提示，低叶酸水平增加了CVD终点事件的发生风险。一项涉及2.7万人，平均随访时间为4.4年的中国人群队列研究[9]结果显示，叶酸缺乏组(<4 ng/ml)患冠心病的风险为非缺乏组的1.33倍。而本研究发现，与叶酸4.55～6.96 ng/ml组比较，<4.55 ng/ml组发生CVD终点事件的风险更高(HR=1.56)。

3.2血清叶酸浓度在不同性别间存在差异[10]。日本的一项关于叶酸水平与精神分裂症的横断面调查[11]提出，有必要进行基于性别的叶酸水平与疾病的关联性分析。但目前，关于叶酸水平与CVD终点事件的关联性研究仍鲜有。本研究就此进行了补充，结果提示，不论性别情况，低叶酸水平均为促进CVD终点事件发生的危险因素；而对于女性人群，过高或过低的叶酸水平均促进了CVD终点事件的发生。在2017年，有学者发现较高的叶酸水平会升高冠心病的发生风险(OR=1.85，95%CI：1.56～2.20)[12]。而美国学者Nkemjika等[13]通过队列研究发现，较高或较低的叶酸水平均可增加CVD死亡风险。而本研究结果提示，叶酸水平与CVD终点事件的关联存在性别差异，这也部分解释了前期关于叶酸水平与CVD发病及死亡关联存在不一致的结论。有研究[14]认为可将叶酸作为谷物的添加成分预防CVD的发生，临床上也常常将叶酸片等B族维生素制剂作为高Hcy患者的CVD二级预防药物。本研究结果提示在进行这些干预前应充分考虑性别差异。

3.3叶酸不足可以通过影响血管内皮的功能、增加胰岛素抵抗、干扰DNA的甲基化过程和诱导Hcy水平升高等途径损伤心脑血管系统[15-16]，其中高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia,HHcy)作为叶酸缺乏的主要结果，被大量的研究认为是促发CVD终点事件的独立危险因素[17]。而本研究在校正了Hcy水平后仍显示叶酸水平与CVD终点事件存在显著关联，提示两者可能存在独立于Hcy的相关关系，这与Morrison等[18]的研究结果相似。对于高叶酸导致CVD终点事件发生风险升高的机制，既往有研究认为这与高叶酸浓度导致非结合叶酸水平的急剧上升，进而加快叶酸降解速度有关[19]。高浓度叶酸通过上调甲基化水平导致DNA和组织蛋白的表观遗传修饰异常，从而影响基因的表达，这种损伤对上皮细胞等快速增殖组织影响明显。在血管粥样硬化的病理机制中，甲基化异常促进了血管平滑肌细胞的增殖和迁移这一重要过程[20]。

3.4本研究采用自然人群队列研究设计，能够明确叶酸水平与CVD终点事件的因果关系，同时，我国目前尚未施行全民叶酸补充计划，国民叶酸水平处于自然状态，较少受到干扰。但是，本研究也存在一些不足之处，如随访时间仍较短，需延长随访时间以进一步明确结论。

综上所述，低叶酸水平与发生CVD终点事件的风险增加有关，而对于女性，较高的叶酸水平也同样会增加此类事件发生的风险。因此，在考虑通过补充叶酸预防CVD时应考虑性别差异的因素。