鲁卡帕尼对于鱼藤酮诱导的SH⁃SY5Y细胞凋亡的影响

卢意 卜璐璐 林淡钰 梁嫣然 井秀娜 陶恩祥

帕金森病（PD）是临床上常见的一种神经退行性疾病，其发病率其次于阿尔茨海默病，中脑黑质致密部多巴胺能神经元的进行性丢失和路易体形成是它的主要病理特征。帕金森病的具体发病机制尚未明确，受氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、线粒体功能障碍等多方面影响，有效抑制细胞凋亡是改善PD 的主要途径之一［1］。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）是一种DNA 修复酶，参与DNA 的损伤识别和信号传导等过程［2］，鲁卡帕尼是一种常见的PARP 抑制剂，目前已经用于卵巢癌等多种癌症的治疗，其通过减少肿瘤细胞的DNA 损伤修复起到对肿瘤细胞的杀伤作用。近来有研究发现PARP 抑制剂对于创伤性颅脑损伤的神经细胞具有保护作用，而其对帕金森病中神经细胞的凋亡的影响还未有明确的说明［3］。本实验利用PARP 抑制剂鲁卡帕尼干预鱼藤酮对于SH⁃SY5Y 细胞的作用，检测细胞的生存率、凋亡率以及凋亡相关蛋白bcl⁃2 和bax 的蛋白表达量，探讨PARP 抑制剂鲁卡帕尼对于鱼藤酮诱导的SH⁃SY5Y 细胞凋亡的影响，从而希望能对帕金森病的诊治提供新的药物靶点和思路。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器实验中所用SHSY⁃5Y 细胞即人神经母细胞瘤细胞由本课题组长期保存，PARP抑制剂rucaparib 鲁卡帕尼购自Biofroxx 公司，细胞凋亡试剂盒购自美国thermofisher 公司，DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibco 公司，全反式维甲酸、Tris base、甘氨酸、十二烷基硫酸钠（SDS）购自sigma 公司，BCA 法测蛋白试剂盒、SDS⁃PAGE 凝胶配制试剂盒、RIPA 细胞裂解液购自上海碧云天科技有限公司，PVDF 膜购自Millipore 公司，Bcl⁃2、Bax 抗体购自abcam 公司。

1.2 细胞培养SY⁃SH5Y 细胞用含10%的胎牛血清（FBS）及1%双抗的DMEM 培养基，置5%的CO2、37℃的恒温培养箱中培养。待细胞长至密度达到70%-80%时用胰酶消化按1∶5 比例传代，传代时加入维甲酸至终浓度20 μmol/ml 诱导分化7天后作为体外细胞神经元模型使用。

1.3 细胞分组处理取对数生长期的SH⁃SY5Y细胞分为对照组、模型组以及鲁卡帕尼三组，用胰酶消化正处于对数生长期的SH⁃SY5Y 细胞，待细胞贴壁后不同分组进行不同处理，对照组细胞更换新鲜培养基后继续培养，鱼藤酮组细胞更换含有10 μmol/L 的鱼藤酮的新鲜培养基继续培养24小时，鲁卡帕尼组更换含有5 μmol/L 鲁卡帕尼的新鲜培养基处理1 小时后向培养基内加入鱼藤酮至鱼藤酮终浓度为10 μmol/L 继续培养24 小时。

1.4 CCK8 检测细胞活性细胞用胰酶消化后调整浓度为（2-5）×104个/ml，取100 μl 单细胞悬液接种于96 孔板继续培养24 小时后，根据不同分组进行不同处理后，向每孔加入10 μl CCK⁃8 溶液，将培养板在培养箱内孵育4 h 后，用酶标仪测定450 nm 处的吸光度，按照说明书计算各组细胞存活率并进行比较。

1.5 Western blot 检测各组bcl⁃2、bax 蛋白表达情况SH⁃SY5Y 细胞按每孔2×105个接种于6 孔板内，待细胞贴壁后根据分组进行不同的加药处理后，保留细胞原培养基，胰酶消化离心后得细胞沉淀，分别提取各组孔内细胞总蛋白，BCA 法检测各组蛋白浓度进行蛋白定量配平，配置10%SDS⁃PAGE 凝胶进行凝胶电泳，每孔上样量为30 μl，后电转至PVDF 膜上，用5% BSA 封闭一小时后加入目的蛋白的一抗稀释液（1∶1 000）4℃摇床过夜，TBST 洗膜后，二抗孵育条带1 小时后再次用TBST 清洗条带后，加入化学显影发光液用Genesystem 软件显影，是用Image J 对得到的蛋白条带进行分析，比较各组bcl⁃2、bax 蛋白表达量的差异。

1.6 细胞凋亡检测细胞接种于6 孔板内，贴壁后根据分组进行不同的加药处理后用胰酶消化细胞，1 000 rpm/min 离心5 分钟后弃去上清，PBS重悬细胞后再次离心弃上清，400 μl binding buffer重悬细胞后将细胞分为两管，一管为空白对照，另一管加入5 μl Annexin V⁃FITC，混匀后避光孵育15分钟后，加入10 μl PI 试剂，混匀后用流式细胞检测仪检测细胞凋亡率，比较各组细胞凋亡率的差异。

1.3 统计学方法采用SPSS 25.0 软件对实验数据进行，定量资料以（）表示，采用t检验进行分析，P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 鲁卡帕尼对鱼藤酮处理的SH⁃SY5Y 细胞活力的影响见图1。

图1 鲁卡帕尼对鱼藤酮处理的SH⁃SY5Y 细胞活力的影响

2.2 鲁卡帕尼对于SH⁃SY5Y 细胞bcl⁃2、bax 蛋白表达量的影响见图2。

图2 鲁卡帕尼对于SH⁃SY5Y 细胞内凋亡相关蛋白表达的影响

2.3 鲁卡帕尼对于鱼藤酮诱导的细胞凋亡的影响如图3。

图3 鲁卡帕尼对于鱼藤酮诱导的细胞凋亡的影响

3 讨 论

细胞凋亡，即细胞程序性死亡，是机体为维持自身内环境稳定，由多种基因调控的复杂过程。B 细胞淋巴瘤⁃2（B⁃cell lymphoma⁃2，Bcl⁃2）基因家族在细胞凋亡的调控中起重要作用，其包括抗凋亡蛋白（Bcl⁃2、Bcl⁃xl、Bcl⁃w、Mcl⁃1 等）和促凋亡蛋白（bax、bak、bad、bim 等）［4］。神经细胞的凋亡会严重影响正常神经系统发育过程以及导致一系列神经退行性疾病。越来越多研究发现，神经元细胞凋亡与帕金森病人中脑黑质神经元丢失密切相关。

鲁卡帕尼是作用靶点为PARP⁃1 的PARP 抑制剂，PARP⁃1 是PARP 蛋白家族中起DNA 修复作用的重要组成部分，主要通过碱基切除修复对DNA单链损伤进行修复［5，6］。1985年，Berger发现DNA的过度损伤会引起PARP 的过度激活造成细胞ATP的大量丢失而导致细胞死亡［7］，同时PARP 的过度激活也会引起细胞内的炎症介质的过度表达和细胞凋亡［6］。PARP 抑制剂对于神经元细胞损伤的保护作用已经引起众多神经学者的关注，目前已有研究证明PARP 抑制剂可改善小鼠颅脑损伤导致的运动功能障碍及急性神经元退行性病变［8］。

综上所述，本研究通过研究鲁卡帕尼对于鱼藤酮诱导的SH⁃SY5Y 细胞的凋亡发现其对于神经元细胞凋亡的抑制作用，且对PD 模型细胞的死亡有逆转作用。这为帕金森病的研究提供了新的思路，对PD 药物的研制提供了新靶点。