TLR9 mRNA表达水平与SLE患者病情及疾病进展的相关性

刘志明 郜苗苗 邵丽丽 朱翠敏 刘秀芬

作者单位：沧州市中心医院儿科，河北，沧州061000

系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythemato⁃sus，SLE）是典型的自身免疫性疾病，随着疾病的进展可累及多个脏器，以肾脏损伤最为常见［1］。在预测SLE 患者疾病进展及预后方面预测难度大。既往对SLE 疾病进展的研究主要集中在评估患者临床表现及实验室检查参数方面，但预测效果不尽人意［2］。随着对SLE 深入研究证实肾功能不全是SLE 预后最可靠的预测因子［3］，然而，目前尚无准确预测SLE 预后的生物标志物。Toll 样受体9（Toll⁃like receptors⁃9，TLR9）是参与非特异性免疫的重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁，广泛表达于SLE 患者单核细胞、T 细胞和B细胞中的跨膜受体中。也有研究表明，TLR9 mRNA的表达与SLE 疾病活动性相关［4⁃5］。但少有研究将TLR9 mRNA表达水平用于预测SLE 疾病进展风险的预测，基于此，本研究通过测定TLR9 mRNA的表达水平，并探讨其与SLE 患者疾病进展的相关性。

1 资料和方法

1.1 临床资料

纳入2016年6月至2018年3月在本院诊断及治疗的SLE 患者129 例。其中男性3 例，女性126例；平均年龄（42.87±9.78）岁；平均病程（6.74±2.12）月。纳入标准：①符合SLE 诊断标准，并确诊为SLE 的患者［6］；②入组前未使用类固醇或免疫抑制剂等；③临床资料完整；④签署知情同意书。排除标准：①合并其他器官或组织肿瘤；②合并严重心血管系统疾病；③活动性感染；④依从性差，不配合随访者。本实验经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法

所有入组患者均参照2010年版中华医学会风湿病学分会制定的《系统性红斑狼疮诊断及治疗指南》［7］的治疗方案进行治疗，包括甲基强的松龙［Pfizer Italia S.r.l。（意大利），批准文号H20150245］0.5 mg/kg/d，羟氯喹（上海上药中西制药有限公司，国药准字H19990263）400 mg/d，环磷酰胺（通化茂祥制药有限公司，国药准字H22022673）100 mg/2d，霉酚酸盐（上海罗氏制药有限公司，国药准字H20031277）25 mg/kg/d，环孢素（杭州中美华东制药有限公司，国药准字H20031277）3 mg/kg/d，甲氨蝶呤（通化茂祥制药有限公司，国药准字H22022674）10～15 mg/w，硫唑嘌呤［Excella GmbH（德国），批准文号H20170288］50 mg，2 次/d。

1.2.2 TLR9 mRNA 表达水平测定

收集所有患者在免疫抑制治疗前和2年后的外周静脉血样本2 mL；在4℃，1 000 r/min 的条件下离心10 min，使用总RNA 提取试剂盒（购自Thermo Fisher Scientifc 公司）进行提取，提取后置于-80℃冰箱保存。使用TRIzol 从全血中分离总RNA；使用BioTek SynergyTMH1 杂交解读器测定RNA 纯度；使用Takara Biotechnology 公司生产的PrimeScript RT 试剂盒将RNA样本逆转录为cDNA；使用Thermo Fisher Scientific 生产的SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒和ABI 7500 Real⁃Time PCR 系统检测TLR9 mRNA相对于GAPDH 的水平；定量测量使用2⁃ΔΔCt方式。引物序列为：TLR9正向，5′⁃CTG CCT TCC TAC CCT GTG AG⁃3′和反向，5′⁃GGA TGC GGT TGG AGG ACA A⁃3′；GAPDH正向，5′⁃CGG ATT TGG TCG TAT TGG G⁃3′和反向，5′⁃TCT CGC TCC TGG AAG ATG G⁃3′。

1.3 观察指标

收集两组患者一般资料包括年龄、性别、BMI等；实验室检查资料包括持续性蛋白尿、C 反应蛋白水平、IgG、C3、C4、IgA、IgM、SLEDAI、白细胞计数、肾小球滤过率、血清肌酐等。

1.4 随访

两组患者均门诊随访2年，随访项目包括SLE病情及疾病进展情况，对病情加重的患者调整治疗方案，随访截止时间2020年3月17日。疾病进展定义为在随访期间患者出现SLE 相关性死亡或活动性疾病。

1.5 统计学处理

采用SPSS 20.0 统计软件对数据进行分析，计量资料以（）表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料采用n（%）表示，采用χ2检验；采用Logistic回归方程分析SLE病情及疾病进展的独立危险因素，绘制工作特征曲线（ROC）评估TLR9mRNA 的表达水平与SLE 病情及疾病进展的相关性，K⁃M 生存曲线分析不同TRL9mRNA 表达水平的SLE 患者疾病进展风险；以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SLE 患者疾病进展情况及分组

随访2年，截止末次随访时间2020年3月17日，129 例患者共5 例因不同原因失访，共计124例患者完成随访，共60 例患者发生疾病进展，将其作为进展组，余64 例未发生疾病进展的患者作为非进展组。

2.2 两组患者临床资料比较

进展组持续性蛋白尿、c 反应蛋白水平、TLR9mRNA 高于非进展组，差异有统计学意义（P<0.05），其余组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 两组患者临床资料比较［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of clinical data between 2 groups［n（%），（±s）］

表1 两组患者临床资料比较［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of clinical data between 2 groups［n（%），（±s）］

临床资料年龄（岁）性别（女/男）BMI（kg/m2）吸烟持续性蛋白尿（g/d）SBP（mmHg）DBP（mmHg）c 反应蛋白水平（mg/L）IgG IgA IgM C3 C4白细胞计数血清胱抑肽C（mg/L）尿酸（μmol/L）BUN（mmol/L）SCr（μmol/L）TLR9 mRNA表达进展组（n=60）41.45±10.47 59/1 24.42±3.51 43 23.75±1.42 146.82±10.81 95.33±10.75 6.14±1.08 21.76±4.61 3.51±0.74 1.45±0.34 0.64±0.17 0.10±0.03 613.18±100.22 2.52±0.80 363.89±78.60 8.56±2.61 73.47±22.73 40451.75±8587.21非进展组（n=64）43.19±12.84 62/2 23.25±3.18 38 12.63±1.87 143.77±10.55 93.47±11.68 4.80±1.51 22.78±4.72 3.84±0.81 1.40±0.30 0.70±0.21 0.11±0.03 649.27±80.57 2.75±0.71 389.65±75.87 8.27±2.34 72.85±23.82 26214.77±6132.57 χ2/t 值0.618 0.279 1.450 2.066 27.760 1.186 0.689 4.249 0.908 1.768 0.647 1.306 1.384 1.646 1.262 1.385 0.485 0.111 7.905 P 值0.539 0.597 0.152 0.151<0.001 0.240 0.494<0.001 0.367 1.768 0.260 0.098 0.085 1.646 0.106 0.085 0.314 0.111<0.001

2.3 SLE 患者疾病进展风险的预测因素分析

Logistic 多因素显示持续性蛋白尿、c 反应蛋白水平、TLR9mRNA 表达水平是SLE 患者疾病进展风险的独立危险因素。见表2。

表2 多因素Logistic 分析结果Table 2 Multi⁃factor Logistic analysis results

2.4 两组患者疾病进展发生风险比较

以TLR9mRNA 表达水平中位数为界值，分为TLR9 低表达组（n=62）和TLR9 高表达组（n=62）；K⁃M 生存分析曲线显示，TLR9 高表达组SLE 患者2年疾病进展风险高于TLR9 低表达组（log⁃rankχ2=5.971，P=0.015）。见图1。

图1 两组患者疾病进展发生风险比较Figure 1 Comparison of the risk of disease progression between 2 groups

2.5 TLR9 mRNA 表达水平预测SLE 疾病进展风险的效能

钙蛋白酶⁃1 预测TLR9mRNA 表达水平预测SLE 疾病进展风险的AUC 为0.958，高于持续性蛋白尿、c 反应蛋白水平。见表3、图2。

表3 TLR9 mRNA 表达水平预测SLE 疾病进展风险的效能Table 3 The efficacy of TLR9 mRNA expression level in predicting the risk of SLE disease progression

图2 TLR9 mRNA 表达水平预测SLE 疾病进展风险的ROC 曲线Figure 2 The ROC curve of TLR9 mRNA expression level predicting the risk of SLE disease progression

3 讨论

SLE 为自身免疫性疾病，发病机制复杂，其确切机制至今尚未完全清楚［8］。TLR9 是存在于一线防御细胞上的一种识别病原体相关分子模式（pathogen⁃associated molecular pattern，PAMP）的受体［9］。有学者［10］应用系列TLR 配体刺激RAW264.7 发现TLR 能够上调免疫反应；TLR 通过可能通过某种细胞反应诱发机体自身免疫反应或促进自身免疫性疾病进展。

TLR9 由TLR9mRNA 转录而来，是一种跨膜受体，由含亮氨酸重复序列的胞外区、含半胱氨酸的跨膜区以及具有核心元件的胞内区组成，胞内区结构与白介素⁃1 型保内结构域高度同源，具高度保守空间结构，直接参与下游信号传导［11］。既往研究表明［12⁃13］TLR9 在SLE 单核细胞、T 细胞和B 细胞中高表达，活动性SLE 患者中TLR9 表达较非活动期对照升高。本研究结果提示TLR9参与了活动性SLE 的疾病进展机制。

既往研究指出［14］血管炎、血液异常及肾小球肾炎是SLE 患者临床无缓解的独立危险因素。研究表明［15］肾脏、神经功能损伤缓解是SLE 患者预后良好的独立预测因素。本研究结果与以往结果部分相似，证实肾脏功能受累及c 反应蛋白水平升高是SLE 疾病进展的独立危险因素。另发现TLR9mRNA 也是SLE 患者疾病进展的危险因素。ROC 曲线结果说明高水平TLR9 mRNA表达可预测SLE 患者疾病进展。TLR9 在SLE 发病机制中的作用尚未明确。先前动物研究表明［16］TLR9的激活可导致MRL⁃Fas 狼疮易发小鼠肾炎的进展，可能为TLR9 的激活诱发了自身免疫反应，影响了患者自身抗体的产生。在另一项动物研究中敲除SLE 小鼠TLR9 后小鼠抗DNA 成分自身抗体明显减少，主要表现为抗核小体抗体明显减少［17］，而在SLE 中发现核小体、自身抗体等在SLE 疾病的发展过程中起着重要作用。TLR9 及其信号通路与SLE自身抗体的转型有关，在SLE 小鼠模型中发现自身抗体IgG2a、2b亚型是致病的主要亚型［18］，对自身肾小球基底膜、DNA 等是反应性自身抗体。TLR9 及其信号通路与自身抗体向IgG2a、2b亚型密切相关。TLR9 缺失的SLE 小鼠IgG2a、2b亚型水平明显减少，病理损伤明显减轻，生存期也明显延长［19］。提示TLR9mRNA 的高表达SLE 患者存在严重的自身免疫反应，自身免疫反应越重，恢复越困难，致患者预后差。

综上所述，持续性蛋白尿、C 反应蛋白水平、TLR9mRNA 高表达是SLE 患者疾病进展的危险因数，TLR9 参与了SLE 的发病机制，TLR9mRNA高表达可能预测SLE 在2年内的进展情况，因此，TLR9mRNA 高表达水平可作为预测SLE 患者疾病进展风险的重要生物标志物。同时本研究还存在不足之处，本研究测量的TLR9mRNA 表达水平是机体在某一时间点的结果，其不代表整个疾病进展时间段。另外由于样本量较少且来源较单一，会影响研究结果，因此后期我们将进行大样本、多中心、连续时间的研究。