溃疡性结肠炎患者肠组织FOXP3和miR-664a-3p的表达关系及意义

柯乐斌 周垂杨 高仁贤

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)作为一种炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)，主要以结肠和直肠黏膜的弥漫性发炎为特征[1]。近年来UC的发生率呈逐年上升的趋势，已成为世界卫生组织(World Health Organization, WHO)确定的现代不治之症之一，因此尽早探究UC的发病机制及寻找药物靶点具有关键意义[2]。叉头/翼状螺旋转录因子3(forkhead/winged helix transcriptionfactor 3, FOXP3)是CD4+CD25+Tregs细胞的特异性转录标志物[3]；多项研究表明CD4+CD25+Tregs细胞在IBD中发挥着重要作用[4, 5]。据报道，miRNAs在疾病中的异常表达会影响疾病的发生、发展[6]。位于RAB3GAP2内含子区的miR-664a-3p在包括胃癌、宫颈癌、动脉粥样硬化等疾病中均表现出异常表达[7～9]。此外，有研究表明FOXP3在胃癌细胞中可以与miR-664a-3p启动子区结合并激活其表达，但在UC中并未见其报道[7]。因此，本研究通过检测UC患者肠组织中FOXP3与miR-664a-3p表达水平，进而分析二者相关性及医学临床意义。

对象与方法

1.研究对象：选取2019年4月～2020年4月在温州市人民医院确诊的50例UC患者，其中男性29例，女性21例，患者平均年龄43.04±15.72岁，有吸烟史27例。依据肠镜下的病变范围将UC患者分为远端结肠炎34例和广泛结肠炎16例，并按照疾病严重程度分为轻度、中度和重度(参照改良的Truelove & Witts评分)。以笔者医院同期收治的50例结肠息肉患者为对照组，其中男性30例，女性20例，患者平均年龄40.06 ± 14.52岁。研究对象纳入前排除感染性腹泻、放射性肠炎、缺血性肠病、肿瘤等疾病，且均对实验知情同意。两组患者平均年龄、性别、吸烟史等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.主要试剂及仪器：TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)，SyBR Green Realtime PCR Master Mix(日本Toyobo公司)，Thermal Cyclers for PCR、CFX96 TouchTMReal-Time PCR Detection System(美国Bio-Rad公司)，Reverse Transcription System(美国Promega公司)。FOXP3、miR-664a-3p引物(上海生工生物工程公司合成)。鼠抗人FOXP3抗体、HRP标记山羊抗鼠二抗(英国Abcam公司)。

3.结肠组织中FOXP3 mRNA和miR-664a-3p水平检测：将样本组织充分研磨后，加入TRIzol试剂按照说明书提取组织RNA，通过DEPC水稀释RNA，在分光光度计下检测样本RNA浓度。在冰上配制反应液，并于Thermal Cyclers PCR仪中进行反转录过程。扩增目的基因引物，进行qRT-PCR。反应条件为95℃ 10min、95℃ 15s、60℃ 1min，循环40次。使用Bio-Rad CFX Manager1.6 软件进行结果分析，利用2-△△CT法计算目的基因mRNA相对表达量。FOXP3上游引物序列为5′-TACTTCAAGTTCCACAACATGCGACC-3′，下游引物序列为5′-CGCACAAAGCACTTGTGCAGACTCAG-3′，miR-664a-3p上游引物序列为5′-ACACTCCAGCTGGGTATTCATTTATCCCCAGCC-3′，下游引物序列为5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；GAPDH上游引物序列为5′-AGCCACCAGATCCGCGTGT-3′,下游引物序列为 5′-TTGAAGTTCTGGATCAGGA-3′，作为内参。

4.Western blot法检测FOXP3表达：按照试剂盒说明检测组织样本中FOXP3蛋白表达，首先通过BCA法测定组织中蛋白含量。SDS-PAGE电泳后转膜封闭2h。孵育FOXP3一抗(1∶1000)过夜(4℃)，孵育二抗90min。洗膜后通过化学发光法(ECL)显影，凝胶成像系统检测FOXP3蛋白表达，以GAPDH为内参。

5.免疫组化法检测FOXP3蛋白表达：对组织样本进行石蜡包埋，5μm切片，并通过二甲苯、乙醇脱蜡处理，放入沸腾的装有0.01mol/L 柠檬酸缓冲液(pH=6.0)的陶瓷缸中持续加热进行抗原修复，PBS洗涤后封闭40min，4℃下过夜孵育FOXP3一抗(1∶100)，次日PBS冲洗后孵育HRP标记的二抗30min，DAB显色、苏木精复染，脱水、透明、封片后于显微镜下观察并获取图像，每张切片随机选取5个高倍视野(×400)，通过Image-Pro Plus 6.0分析图像，结果以平均吸光度值(吸光度值A/阳性面积)表示。

6.观察指标：分析结肠组织中FOXP3和miR-664a-3p水平与性别、年龄、病情严重程度之间的关系。

结 果

1.FOXP3 mRNA、miR-664a-3p表达水平检测：首先通过qRT-PCR检测样本组织中FOXP3 mRNA、miR-664a-3p水平，UC患者结肠组织中FOXP3 mRNA(图1A)、miR-664a-3p(图1B)表达量均显著高于对照组(P<0.01)。此外，依据评分划分的轻度、中度和重度患者中，中重度UC患者结肠组织中FOXP3 mRNA、miR-664a-3p相对表达水平相较于轻度患者显著增高(P<0.01)。

图1 组织样本中Foxp3 mRNA和miR-664a-3p相对表达水平比较A.FOXP3 mRNA相对表达水平；B.miR-664a-3p相对表达水平

2.FOXP3蛋白表达情况：Western blot法检测结果(图2A)显示，相较于对照组UC组中FOXP3蛋白表达显著增加，此结果与mRNA检测结果一致。进一步进行免疫组化检测，据了解FOXP3免疫阳性物质定位于细胞核，细胞核出现棕黄色则为阳性细胞。图2B结果显示，UC患者结肠组织中，FOXP3+细胞显著多于对照组(P=0.000)；且中重度患者相较于轻度患者，FOXP3表达显著升高(P=0.000)。

3.UC患者结肠组织中FOXP3、miR-664a-3p表达与病情相关性：在验证UC患者结肠组织中FOXP3和miR-664a-3p明显高表达之后，为了研究FOXP3和miR-664a-3p与患者病情的相关性，根据FOXP3 mRNA和miR-664a-3p在qPT-PCR结果中相对表达的中位值，将50例样本分为高表达组和低表达组，每组25例。采用χ2检验检测miR-664a-3p和FOXP3与患者病情的相关性。UC患者结肠组织中FOXP3、miR-664a-3p水平与临床病情严重程度呈正相关(χ2=10.160、13.120)，差异有统计学意义(P<0.05)，而且结果与患者性别、年龄、吸烟史均无关(P>0.05),详见表1。

表1 UC患者结肠组织中FOXP3、miR-664a-3p表达与临床病理特征的关系

4.FOXP3与miR-664a-3p表达的相关性分析：通过Pearson方法分析组织样本中FOXP3与miR-664a-3p表达的相关性，显示FOXP3与miR-664a-3p表达呈正相关(r2=0.512，P=0.000)，详见图3。

图3 FOXP3与miR-664a-3p表达相关性分析

讨 论

炎症性肠病(IBD)是一类消化道慢性炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(Crohn disease, CD)[10]。UC主要表现为弥漫性肠黏膜及黏膜下炎症，包括固有层和隐窝内中性粒细胞和淋巴细胞浸润，严重者则导致溃疡形成。UC的病因复杂，主要包括遗传、饮食和环境等因素[11]。目前，常用的治疗手段(如类固醇和免疫抑制剂药物)会使患者产生不良反应[12]。因此当前的研究主要集中在减少UC发生率的预防措施上。Tregs细胞是具有免疫调节作用的CD4+T细胞亚群，能通过细胞接触依赖或非细胞接触依赖机制维持机体免疫稳态，从而影响机体免疫性疾病、感染、肿瘤等疾病的发生、发展[13]。FOXP3在Tregs细胞的发育、成熟及生物学功能中发挥着至关重要的作用[3]。miR-664a-3p在消化道疾病胃癌及其他疾病中显著高表达[7]。目前仅发现miR-664a-3p可以通过hippo通路靶向MOB1A促进胃癌的发展。本研究中基于生物信息学分析发现，miR-664基因启动子中存在FOXP3结合区，FOXP3作为miR-664a-3p的转录因子可以激活miR-664a-3p的表达，从而促进胃癌的发展[7]。但目前关于FOXP3与miR-664a-3p的表达关系在UC组织中暂无研究，因此本研究主要探讨FOXP3与miR-664a-3在UC中的表达水平及其临床意义。

FOXP3属于叉头翅螺旋转录调节剂家族，其编码基因定位于人类性染色体Xp11.23。FOXP3编码的蛋白能够通过Forkhead结构域与DNA特定位点结合，参与对目的基因的调控[14]。调节性T细胞(Tregs)，尤其是CD4+CD25+Tregs在抑制免疫反应和协调免疫耐受中至关重要[15]。FOXP3可以通过与关键免疫抑制分子(如细胞毒性T淋巴细胞抗原，CTLA4)的相关靶基因结合调控其表达水平[16]。此外，FOXP3能够通过成熟的树突状细胞诱导CD4+CD25-T细胞向CD4+CD25+Tregs细胞转化，影响Tregs的分化和功能[17]。Hori等[18]在此前研究中指出，CD4+CD25-T细胞中FOXP3的异常表达能够赋予Tregs表型以预防IBD。近年来研究发现，FOXP3在包括UC在内的多种疾病中发挥着重要作用[19～22]。目前，在UC发病的分子机制研究中，多采用结肠息肉患者作为对照组[23～25]。有研究显示，在UC与结肠息肉患者组织中，FOXP3表达水平比较差异有统计学意义[26,27]。本研究通过qRT-PCR和Western blot法检测FOXP3表达水平，发现UC组FOXP3 mRNA水平显著高于结肠息肉患者对照组(P<0.05)，免疫组化结果也显示UC组FOXP3阳性率显著高于对照组(P<0.05)。此外，临床病理特征比较结果说明患者结肠组织中FOXP3与临床病情严重程度呈显著正相关(P<0.05)，以上结果一致说明FOXP3会促进UC的发展。

miR-664a-3p在不同疾病中发挥不同的作用，如Yoneda等[28]通过微阵列和PCR分析患有牙周炎或健康的受试者的血清miRNA谱，发现miR-664a-3p在患有牙周炎的受试者中显著高表达。Modak等[29]研究发现与对照组比较，心源性卒中患者中miR-664a-3p的表达具有差异性。此外，在乳腺癌、宫颈癌和骨肉瘤等疾病中也发现miR-664a-3p发挥重要作用[8]。更重要的是，在消化道疾病胃癌中发现了miR-664a-3p的异常表达[7]。然而，其在UC中的作用及潜在机制尚未见研究。本研究通过qRT-PCR 法检测miR-664a-3p水平，结果显示UC组中miR-664a-3p表达量显著高于对照组(P<0.05)，说明miR-664a-3p与UC的发生、发展密切相关。临床病理特征比较结果显示，患者结肠组织中miR-664a-3p与临床病情严重程度呈显著正相关(P<0.05)，说明miR-664a-3p可以促进UC的发展。此外，FOXP3与miR-664a-3p表达呈显著正相关(P<0.05)。

综上所述，本研究发现UC患者结肠组织中FOXP3、miR-664a-3p表达水平增高，二者呈正相关，并且与UC疾病严重程度相关，可以作为UC诊断的标志物，也为研究临床治疗UC的新靶点奠定了基础。但本研究未纳入细菌性肠炎、缺血性肠病等其他肠道炎症性疾病，故无法全面评估结肠FOXP3、miR-664a-3p表达与UC之间的确切关系，此外FOXP3、miR-664a-3p在UC发生过程中的具体机制也有待于进一步研究。