人参皂甙Rbl对心力衰竭大鼠心肌细胞钙调控的影响△

孔宏亮，赵雨婷，蒋玉昆

［1.辽宁省人民医院（中国医科大学人民医院）心脏中心，沈阳 110013；2.大连医科大学第二附属医院心内科，辽宁大连 116023］

在方剂“君臣佐使”配伍中居“君”位的人参广泛应用于心血管疾病的治疗，其重要成分人参皂甙Rbl（ginsenosides-Rbl，Gs-Rbl）可显著改善心肌细胞耐缺氧能力和心力衰竭等［1-7］，其机制主要与改善心肌重构、减轻心肌细胞凋亡和自噬、改善心肌代谢、调节肌质网应激和抗炎等有关［1-9］。心肌细胞内Ca2+（intracellular calcium，iCa2+）浓度变化是细胞生理功能的重要基础，所有这些决定于Ca2+的跨膜转运、细胞内钙库摄取和释放等，iCa2+循环失调是心力衰竭发生、发展的重要特征［10-14］。肌质网和线粒体等细胞器的Ca2+稳态对维持心肌iCa2+循环起着十分重要的作用［10-14］，其中线粒体Ca2+（mitochondrial calcium，mCa2+）既有效调节心肌iCa2+稳态又高效调节线粒体“呼吸”功能及细胞信号传导系统等，从而维持心肌细胞功能的高效性［10-14］，心力衰竭可促发mCa2+超载和失衡并因此加重心力衰竭［10］，改善mCa2+超载和失衡即可有效减轻心力衰竭［10］。Gs-Rbl 可通过抑制缺氧心肌细胞线粒体通透转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）的开放而改善心肌细胞的耐缺氧能力［9］，而mPTP 介导mCa2+稳态［10-14］。当前“强心”药物主要通过心肌iCa2+和（或）增加心肌收缩蛋白对iCa2+的敏感性提高心肌收缩力，但具有“多靶点”效应的Gs-Rbl 是否通过调节iCa2+等改善心功能并不清楚。

1 材料和方法

1.1 材料及仪器

动物：雄性Wistar 大鼠购自中国医科大学动物试验中心［SCXK（辽）2015-0009］，体质量150～200 g。试剂：阿霉素购自Sigma 公司，Gs-Rbl（纯度96%）购自中科院昆明植物研究所，氨基末端脑钠肽前体（N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自Invitrogen 公司。仪器包括二维心脏超声（Ving⁃med CFM-725，7.5 MHz broadband transducer，USA），低温离心机（Hitachi），低温超速离心机（2K15C 型，Sigma），激光扫描共聚焦显微镜（CellInsight CX7 LZR，Thermo fisher scientific Inc），荧光分光光度计（日立F-7000），Fluo-3/AM（Invitrogen）、Fluo-5N/AM（Invitrogen）、Fura-FF（Invitrogen）和JC-1（Enzo Life Sciences）等。

1.2 心力衰竭大鼠模型构建方法

按以前的方法成功构建大鼠心力衰竭模型［3］：根据大鼠体质量腹腔内注射阿霉素，每3日1次，每次2 mg/kg，连续5 次；之后每周1 次，每次2 mg/kg，共5 次。在最后干预2 周后，对大鼠行心脏超声检查确认成模，之后随机分为心力衰竭组（n=16）和Gs-Rb1 组（n=18），同时随机选同龄健康大鼠腹腔内注射等量0.9%氯化钠溶液（按阿霉素注射方法）作为对照组（n=10）。除Gs-Rb1 组饮食中添加Gs-Rbl［70 mg/（kg·d），1 日3 次］外，其他所有大鼠均常规喂养。4 周后大鼠均行心脏超声检查。

1.3 心脏超声检查方法

按下述方法行二维心脏超声检查［3］：腹腔内注射10%水合氯醛（0.3～0.4 mg/l00 g 体质量），麻醉后（15～20 min）仰卧位固定，心脏超声评价心功能，间断3 次测定相关指标取其均值获得左心室短轴缩短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）和左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）：LVEF=（左心室舒张末横截面积-左心室收缩末横截面积）/左心室舒张末横截面积，LVFS=（左心室舒张末内径-左心室收缩末内径）/左心室舒张末内径。LVEF<45%被作为左心衰竭标准。

1.4 酶联免疫吸附试验法测定氨基末端脑钠肽前体浓度

根据试剂盒说明检测各组大鼠的NT-pro-BNP 浓度。

1.5 心肌细胞分离方法

每组各取5 只大鼠肝素化分离心肌细胞，其他大鼠取全血后分离、提取左心室，-80 ℃保存准备后续检测。采用酶解法分离心室肌细胞［17］：将肝素化大鼠迅速开胸取心，用4℃无钙台式液清洗、剪除脂肪组织、修剪主动脉长度并行主动脉插管，于Lan⁃gendorff 装置下逆行灌流（37℃，流速6～7 mL/min，100%氧饱和）。无钙台式液灌流7～8 min 后，以含Ca2+（60 μmol/L）的Ⅱ型胶原酶（0.6 mg/mL）台氏液灌流，8～10 min 后剪下心室部，于Kraft-Bruhe（KB，37 ℃）液中剪碎心室肌，缓慢吹打1 min 后用200 目尼龙网过滤、室温下沉淀10～15 min，取沉淀液复钙；每次复钙10 min，先后加入复钙液A、复钙液B、复钙液C 和复钙液D，将细胞外液钙浓度逐步复钙为1.2 mmol/L；弃上清液并加入KB 液室温静置1～2 h 备用。

1.6 钙荧光染色方法

钙荧光指示剂Fluo-3/AM、Fluo-5N/AM 分别溶解于二甲基亚砜（DMSO），终浓度均为10 μmol/L。取各组心肌细胞分别于Fluo-3/AM 溶液（室温孵育30 min，KB 液漂洗3 次，每次5 min）、Fluo-5N/AM（37 ℃孵育2.5 h，KB液漂洗3次，每次5 min）在避光条件下孵育。然后在37℃温箱中静置1.5 h后备用。

1.7 钙瞬变记录

室温（20℃～22℃）下，将孵育好荧光染料Fluo-3/AM 的细胞置于含细胞外液的细胞池中，同时应用5 mmol/L氯化镍和100 nmol/L毒胡萝卜素分别阻断心肌细胞钠钙交换蛋白（sodium-calcium exchanger，NCX）和肌浆网钙泵（sarcoplasmic reticulum calci⁃um adenodine triphosphatase，SERCA2a），用激光扫描共聚焦显微镜记录单个心肌细胞的钙诱导钙瞬变，包括动作电位诱导的钙瞬变（即钙火花频率，以细胞内的平均荧光强度表示）和钙瞬变峰值（以ΔF/F0 表示）。物镜为40 倍油镜，数值孔径为1.25；激发光波长为-488 nm，在波长-500～560 nm 收集发射波长。共聚焦显微镜成像采用线扫描方式（每条线1 024 像素，速率2 ms/线）。二维平面扫描获得细胞整体范围后，调节焦平面位置选取合适细胞层面（即荧光分布均匀且尽可能避开细胞核所在层面），之后将扫描线置于细胞长轴纵向正中切面中央，线扫描方式与局部场刺激配合下记录胞内钙瞬变。

1.8 肌质网内Ca2+浓度检测

室温下，将孵育好荧光染料Fluo-5N/AM 的细胞置于含细胞外液的细胞池中。按上述激光共聚焦扫描显微镜参数，采用面扫描方式记录心肌细胞钙瞬变，其直接表示肌质网内的Ca2+浓度（采样速率20 s/帧），以ΔF/F0 表示。

1.9 荧光分光光度计检测线粒体Ca2+摄取和释放

提前3 周经尾静脉注射1×1 011 粒AAV6-mi⁃tycam 粒子，试验结束时按上述方法分离心肌细胞并即刻检测mCa2+摄取（0.1 Hz 起搏），检测mCa2+摄取和流出定量前均消除背景荧光评估。37 °C 下，心肌细胞（3.0×106）在类似细胞内液培养液中孵育，柔和搅动心肌细胞并添加1 μmol/L Fura-FF 或1 μmol/L JC-1 以便检测线粒体内外Ca2+。该仪器以激发波长490 nm/发射波长535 nm 检测荧光信号，以340～380 nm 激发波长/510 nm 发射波长检测Fura-FF；350 s 后每隔60 s 添加10 μmol/L Ca2+，线粒体外Ca2+的清除代表mCa2+摄取。以570 nm 激发波长/595 nm 发射波长检测JC-1 聚合物，在550 s后加入1 μmol/L Ru360（MCU 抑制剂）以抑制mCa2+摄取和释放，有助于定量mCa2+释放。

1.10 统计学分析

采用SPSS 20.0 软件包进行统计学处理。计量资料以（）表示，用One-way 方差（One-way ANOVN）Dunnett′s t3（3）进行统计学分析。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠左心功能指标比较

在本研究过程中，各组大鼠均没有死亡。阿霉素干预可显著降低大鼠LVFS、LVEF 和升高其血清NT-pro BNP 浓度，而Gs-Rb1 干预可显著提高心力衰竭大鼠的LVFS、LVEF 和显著降低血清NT-pro BNP 浓度，详见图1 和表1。

图1 各组大鼠LVFS 比较

表1 各组大鼠左心功能指标比较 ［］

表1 各组大鼠左心功能指标比较 ［］

注：与对照组比较，**P<0.01；与心力衰竭组比较，1）**P<0.01

2.2 各组大鼠心肌细胞钙火花频率和钙瞬变峰值比较

为明确Gs-Rb1 对心力衰竭大鼠钙瞬变的影响，本研究在各组大鼠均记录10 个心肌细胞的钙瞬变，结果显示心力衰竭组大鼠动作电位过程中钙火花频率和钙瞬变峰值均显著低于对照组，而Gs-Rb1 可显著提高心力衰竭大鼠心肌细胞的钙火花频率和钙瞬变峰值，详见图2 和表2。

图2 各组大鼠动作电位诱导的钙瞬变（上面为各组大鼠的荧光图，下面为各组大鼠相应的的三维立体荧光图）

表2 各组大鼠钙火花频率和钙瞬变峰值比较 ［］

表2 各组大鼠钙火花频率和钙瞬变峰值比较 ［］

注：与对照组比较，**P<0.01；与心力衰竭组比较，1）**P<0.01

2.3 各组大鼠心肌细胞肌质网内Ca2+浓度比较

为了明确Gs-Rb1 对心力衰竭大鼠心肌细胞肌质网内Ca2+浓度的影响，本研究在各组大鼠均记录10 个心肌细胞肌质网内Ca2+浓度，结果显示心力衰竭组大鼠单个心肌细胞Fluo-5N/AM 染色后的荧光强度和荧光强度显著下降，而Gs-Rb1 可显著改善心力衰竭大鼠单个心肌细胞荧光强度和荧光强度变化，详见图3 和表3。

图3 各组大鼠心肌细胞肌质网内钙瞬变图像（上面为各组大鼠的荧光图，中间为各组大鼠相应的的三维立体荧光图，下面为荧光强度的动态演变图）

表3 各组大鼠心肌细胞肌质网内Ca2+浓度比较［］

表3 各组大鼠心肌细胞肌质网内Ca2+浓度比较［］

注：与对照组比较，**P<0.01；与心力衰竭组比较，1）**P<0.01

2.4 各组大鼠心肌细胞线粒体的Ca2+摄取和释放比较

为了明确Gs-Rb1 对心力衰竭大鼠心肌细胞线粒体Ca2+摄取和释放的影响，本研究应用荧光分光光度计检测mCa2+摄取和释放，结果显示与对照组比较，心力衰竭组大鼠心肌细胞线粒体的Ca2+摄取和释放显著下降，而Gs-Rb1 可显著改善心力衰竭大鼠的mCa2+摄取和释放，详见表4。

表4 各组大鼠心肌细胞线粒体的Ca2+摄取和释放比较［］

表4 各组大鼠心肌细胞线粒体的Ca2+摄取和释放比较［］

注：与对照组比较，**P<0.01；与心力衰竭组比较，1）**P<0.01

3 讨论

心肌细胞iCa2+循环失衡是心力衰竭发生、发展的基础和终端机制［10］，心肌收缩力和心肌顺应性决定于心肌iCa2+浓度和（或）心肌收缩蛋白对iCa2+的敏感性［10-14］。本研究发现心力衰竭大鼠动作电位过程中钙火花频率和钙瞬变峰值均显著降低，提示心肌细胞的兴奋-收缩藕联机制受损，从而导致心肌收缩无力［11］；Gs-Rb1 干预的心力衰竭大鼠动作电位时程中的钙火花频率和钙瞬变峰值均可得到改善，提示Gs-Rb1 可能通过修复心肌细胞的兴奋-收缩藕联机制提升心肌收缩力；不过，Gs-Rb1 的这一效应并不能使心力衰竭大鼠心功能恢复到正常大鼠的水平。

心肌细胞内游离iCa2+浓度的变化是心肌兴奋-收缩耦联等细胞生理功能的重要基础，其稳态不仅仅取决于Ca2+的跨膜转运，亦取决于心肌细胞内钙库对Ca2+的摄取和释放等。心肌细胞内重要的细胞器肌质网是细胞内重要的钙库之一，其具有Ca2+释放、Ca2+回摄及Ca2+储存三大功能，这些功能是心肌细胞iCa2+循环的重要机制，其功能失调将损害心肌的收缩功能和舒张功能，即引起心功能失调［10-14］。在进一步证实心力衰竭时心肌细胞内的Ca2+浓度下降外，本研究结果显示Gs-Rb1可改善心力衰竭大鼠心肌细胞Fluo-5N/AM 染色的荧光强度和荧光强度，即Gs-Rb1 可能通过调节心肌细胞肌质网的Ca2+浓度改善心脏功能，提示Gs-Rb1 对心肌细胞内肌质网的Ca2+调节具有一定功能，但Gs-Rb1 如何调节心肌细胞内肌质网Ca2+稳态却有待进一步研究。

心肌iCa2+循环亦有赖于线粒体的Ca2+稳态［10-14］，mCa2+在调节心肌iCa2+稳态的同时亦高效调节线粒体“呼吸”功能和细胞信号的传导系统等［14］。心力衰竭常伴发mCa2+超载和失衡从而使病情恶化，改善mCa2+超载和失衡即可有效减轻心力衰竭的症状［12-13］。本研究证实Gs-Rb1 可改善心力衰竭时的mCa2+摄取和释放功能，提示Gs-Rb1 可减轻心力衰竭状态下的mCa2+超载，说明Gs-Rb1 除可能通过线粒体调节心肌细胞内Ca2+浓度外，尚可能调节线粒体功能［9］，二者均是心脏功能完整性的必要调节。本研究并未涉及Gs-Rb1如何介导线粒体的Ca2+摄取和释放功能，此亟待进一步研究。

综上所述，Gs-Rb1 可能通过调控心肌细胞、肌质网和线粒体等的Ca2+“交流”等改善心力衰竭。Gs-Rb1 改善心力衰竭时心肌细胞内肌质网的Ca2+浓度和线粒体的Ca2+稳态可能与心肌细胞内的Ca2+稳态息息相关，其更确切的机制亟待进一步研究。