3种新疆产药材的降血糖作用研究

游凤，孟晋武，肖迪，王金丽，王颖，刘家国

(南京农业大学动物医学院/教育部“动物健康与食品安全”国际合作联合实验室，江苏 南京 210095)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种常见的慢性代谢性疾病，当机体产生胰岛素不足或者发生对胰岛素的反应缺失时，会造成碳水化合物的代谢异常，进而导致血液和尿液中的葡萄糖水平升高，并引起一系列的并发症。近年来，随着人们生活的逐步城市化，以及宠物饲养管理不当，糖尿病在人和宠物中的患病率均呈逐年快速上升的趋势。有调查表明，糖尿病犬猫的平均中位存活期仅为964 d(32个月)[1]。

目前广泛使用的降糖西药及胰岛素均有不同程度的副作用[2-3]。因此，需要开发降糖效果优良且副作用小的降糖药物，中药具有很大的潜力。香茅草、芡实、睡莲花3种新疆产药材资源丰富，分布广泛，且具有归经明确、以及良好的全身性调整作用[4-6]，对内分泌紊乱的纠正有独特效果，且副作用小。以往主要在清热解毒、抗菌抗病毒、增强免疫等方面应用与研究，关于其降糖作用的报道较少。

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是辅助哺乳动物体内碳水化合物转化为葡萄糖的关键酶，在餐后血糖的升高中起着关键作用[7]。因此，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制剂可通过各种机制减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。正常小鼠快速高血糖模型是一种使血糖快速升高的简单灵敏且可操作性强的体内模型，相比于体外降糖试验，该试验使得药物在体内会经历真正的代谢，所得数据更加具有说服力，与真正的糖尿病大鼠模型相比，更加节省时间，且难度降低，是良好的筛选降糖药物的研究模型[8]。本试验主要通过研究3种新疆产药材提取物对2种酶的抑制率，来探究3种药物提取物的体外降糖作用，并且通过研究对快速高血糖小鼠模型的影响来探究其在体内的降糖作用。

1 材料与方法

1.1 动物

ICR小鼠，雄性，体重(18～20 g)共25只，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，动物合格证号：201920941，动物许可证号：SYXK(苏)2017-0001。

1.2 受试药物及准备

香茅草、睡莲花由新疆农业大学提供，芡实购自江苏天晟医学科技有限公司，产地为新疆。

香茅草：室温下，称取香茅草20 g，按料液比1∶20加入400 mL蒸馏水，煮沸，维持沸腾40 min，重复2次，置完全冷却，3层滤纸过滤，取煎液，然后加入到真空旋转蒸发仪中浓缩至每毫升2 g生药。

睡莲花：室温下，称取睡莲干花20 g，按料液比1∶20加入400 mL(淹没过药末表面)70%的乙醇超声波萃取，超声温度56 ℃，超声时间40 min，重复两次。3层滤纸抽滤。然后加入到真空旋转蒸发仪中浓缩至每毫升2 g生药。

芡实：室温下，取一定量的芡实，进行粉碎之后取芡实粉末20 g，按料液比1∶15加入300 mL 70%的乙醇，放置在90 ℃水浴锅中水浴4 h，3层滤纸抽滤，然后加入到真空旋转蒸发仪中浓缩至每毫升2 g生药。

1.3 试剂

3, 5二硝基水杨酸/DNS(20180427)购自广东光华科技有限公司；可溶性淀粉(1711092)购自西陇科学股份有限公司；酒石酸钾钠(20180712)购自广东光华科技股份有限公司；α-淀粉酶(L28O8D46151)购自上海源叶生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶(R06D8Y50059)购自上海源叶生物科技有限公司；对硝基苯基-α-D吡喃葡萄糖苷/pNPG(K22J9B64113)购自上海源叶生物科技有限公司；盐酸二甲双胍肠溶片(181103)，购自北京京丰制药有限公司，用去离子水每天现配现用；50%葡萄糖溶液(E18120305)，购自湖南科伦制药有限公司。

1.4 方法

1.4.1 3种新疆产药材的体外降糖作用比较

参照叶琼仙等[9]和苏尧尧[10]的方法，并稍作改进。

对ɑ-淀粉酶活性的抑制能力的检测：将500 μL的待测样品与500 μL 1 U/mL的α-淀粉酶溶液加入试管中，在37 ℃水浴中反应30 min，加入1%的淀粉溶液1 mL，继续37 ℃水浴反应15 min，水浴反应结束后，立即加入1 mL DNS显色剂，并且沸水浴5 min后冷却至室温。按照1∶20的比例加入蒸馏水进行稀释混匀，于540 nm处进行吸光度的测定。

抑制率=(1-(A抑制-A背景)÷A空白)×100%(A指吸光度)，其中：A抑制表示α-淀粉酶溶液+样品+淀粉溶液+DNS显色剂；A背景表示样品+淀粉溶液+DNS显色剂；A空白表示α-淀粉酶溶液+淀粉溶液+DNS显色剂。

对ɑ-葡萄糖苷酶活性的抑制能力的检测：在96孔板中加pH值5.0的磷酸盐缓冲溶液40 μL，加入样品溶液40 μL，再加入7 000 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液40 μL，混匀，在37 ℃下反应30 min，而后加入2.5 mmol/L的pNPG溶液40 μL，继续在37 ℃反应30 min，最后加入100 μL 0.1 mol/L的Na2CO3溶液终止反应。于405 nm波长(测的是PNP)处测定吸光值。

抑制率=(1-(A抑制-A背景)÷A空白)×100%(A指吸光度)，其中：A抑制表示缓冲溶液+α-葡萄糖苷酶溶液+样品溶液+pNPG溶液+Na2CO3溶液；A背景表示缓冲溶液+样品溶液+pNPG溶液+Na2CO3溶液；A空白表示缓冲溶液+α-葡萄糖苷酶溶液+pNPG溶液+Na2CO3溶液。

1.4.2 标准曲线的建立

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性抑制试验均以阿卡波糖(α-葡萄糖苷酶抑制剂)作为阳性对照(阿卡波糖+酶液+底物)，制作标准曲线。

1.4.3 3种新疆产药材对腹腔注射葡萄糖所致小鼠快速高血糖模型的影响比较

所有小鼠适应性饲养7 d后，随机分为5组：芡实提取物组(EUR)、香茅草提取组(CYM)、睡莲花提取组(NYM)、二甲双胍(阳性对照)组(MET)和模型组(Model)。芡实各组每早9:00准时以相应受试物悬液10 g/kg灌胃，阳性药对照组给予二甲双胍75 mg/kg，模型组灌胃等体积生理盐水，灌胃体积均为0.2 mL/20 g，连续灌胃2周。最后一次给药后，各组小鼠禁食(不禁水)6 h，先测量空腹血糖，再分别灌胃给受试药物，给药30 min后，各组小鼠腹腔一次性注射50%葡萄糖溶液0.1 mL/20 g，尾尖采血，用血糖仪测定葡萄糖注射后15、30、45、60、90和120 min时间点的血糖值。血糖值结果用mmol/L表示。采用GraphPad Prism 5.01软件计算曲线下面积(area under the cure，AUC)，比较各组的葡萄糖耐量水平。

1.5 数据统计分析

统计学分析采用SPSS 22.0软件进行，各组数据以“平均数±标准差”表示，两组间差异的显著性采用t检验进行统计学分析，P<0.05表示具有统计学差异。

2 结果

2.1 阿卡波糖对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制标准曲线

如图1、图2可知，阿卡波糖标准曲线呈现随着阿卡波糖浓度的增大，抑制率增加逐渐变缓，即曲线斜率变小的情况，直接用直线对其拟合所得的标准曲线公式R2较大，采用自然对数公式y=aLn(x)+b进行拟合，基本符合曲线走向。

图1 阿卡波糖对α-淀粉酶抑制曲线

图2 阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制曲线

2.2 各受试药物对α-淀粉酶的抑制作用

香茅草提取物和芡实提取物对α-淀粉酶的抑制能力与药物浓度呈正相关，在2 g生药/mL时，二者对淀粉酶的抑制能力最佳，对α-淀粉酶的抑制率分别达88.3%和79.8%，睡莲花提取物在试验中并未表现出对α-淀粉酶有抑制作用。见表1。

表1 各受试药物对α-淀粉酶的抑制作用

2.3 各受试药物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

由表2可知，香茅草提取物和睡莲花提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制能力与药物浓度呈正相关，睡莲花提取物的抑制能力更佳，在1 g生药/mL时，对α-葡萄糖苷酶的抑制率就达76.0%，而芡实提取物在试验中并未表现出对α-淀粉酶有抑制作用，香茅草提取物的抑制能力也较差。

2.4 3种新疆产药材对腹腔注射葡萄糖所致小鼠快速高血糖模型的影响

由表3可知，各组的基础血糖值睡莲花提取物组最低，芡实提取物组最高，在腹腔注射葡萄糖15 min后，各组的血糖值均有显著提升，并达到峰值，其中芡实提取物组的峰值最高，睡莲花提取物组、香茅草提取物组和二甲双胍组的峰值均低于模型组，其中睡莲花组最低，较模型组低10.29%。自30 min开始，各组血糖值开始不同程度的下降，睡莲花提取物组的下降速度仅次于二甲双胍组，在各个时间点的血糖值均低于模型组；比较血糖曲线下面积AUC可以发现，睡莲花提取物组AUC与二甲双胍组相近，均低于模型组，与香茅草提取和睡莲花提取物均有显著差异。而芡实提取物和香茅草提取物组的血糖调节能力较差。

表2 各受试药物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

表3 3种新疆产药材对腹腔注射葡萄糖所致小鼠快速高血糖模型的血糖值影响 mmol/L

3 讨论

作为一种需要终身治疗的慢性内分泌疾病，糖尿病给患宠本身和宠物主人均带来了很大的困扰。防治糖尿病，开发效果优良、副作用更小的降糖药已成为研究热点。

由于传统降糖药物，如二甲双胍类、格列本脲类虽然具有良好的降糖效果，但是其疗效仍然十分有限，不仅无法阻止胰腺进一步坏死，也无法刺激机体产生足够的胰岛素，而且会引起消化系统、泌尿系统等多系统损伤，尤其是肝肾损伤，其严重的胃肠道副作用也使患病动物的生活质量得不到保障。因此，近年来，寻找降糖效果好，且对机体副作用小的新型天然植物降血糖药物逐渐成为研究热点。

香茅草性味温、辛，功效众多，具有祛风通络、和胃通气、温中止痛、止泻、醒脑催情的功效。以往对香茅草的研究主要集中挥发油，但香茅草的水提液和醇提液中含有黄酮、多糖等7种成分，植物多糖是近年来抗糖尿病的热门成分，其能激活过氧化体增殖物激活型受体(PPAR)活性进而激活体内细胞葡萄糖的转运和利用。王琦等[11]测量超声提取的香茅草多糖含量为6.49%。此外，也有报道香茅草的根和叶有胰岛素样物质[12]。因此，香茅草可能具有一定的降糖潜力。芡实在中医上归于肾经和脾经，有健脾利湿益肾、祛湿止带的作用，芡实味甘，常与其他药食同源的中药饮片一同食用，可起到不同的功效；有中医工作者将芡实作为一种辅助食物添入糖尿病患者的主食中，作为早晚餐使用，降糖效果显著[13]；也有研究发现芡实壳三萜类提取物能改善糖尿病小鼠的血糖和血脂，并改善胰岛素抵抗状况[14]。关于芡实总醇提物的降糖效果，目前也未见报道。

在本次试验中，香茅草提取物和芡实提取物均对α-淀粉酶表现出较好的抑制能力，在2 g生药/mL时，其抑制率分别达88.3%和79.8%，表明其具有良好的体外降糖活性，但是其对腹腔注射葡萄糖所致小鼠快速高血糖模型表现出来的降糖效果并不理想。

睡莲花味辛辣、苦甜，其具有清热解毒的功效，其成分多样。近年来对睡莲花的降血糖作用的研究有所增加，发现具有明显的肠内葡萄糖苷酶抑制作用[15]。Rajagopal等[16]对睡莲花醇提物对正常大鼠和四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠的口服葡萄糖耐量情况进行比较，发现其对糖尿病大鼠有一定的降血糖作用，但机制不明；赵军[17]研究了睡莲花的有效成分，在有效成分对二肽基肽酶Ⅳ抑制活性的高通量筛选试验中发现，睡莲花提取物确实具有一定的降血糖作用，并可能与睡莲花多酚含量较高有关。

在本次试验中，睡莲花提取物仅对α-葡萄糖苷酶表现出了抑制作用，对α-淀粉酶活性未表现出抑制作用。景赞等[18]已经证实了蓝睡莲花的多酚类提取物对大鼠小肠麦芽糖酶与α-葡萄糖苷酶有明显的抑制作用，但是对猪胰α-淀粉酶和大鼠蔗糖酶的活性没有明显影响，与本次试验结果基本相符。睡莲花提取物组的AUC仅次于二甲双胍组，虽然与模型组之间没有显著差异，其基础血糖值与注射后15 min峰值都是所有组里面最低的，在30 ～120 min期间的5个时间点里，睡莲花提取物组的血糖值也是要低于其他组的，基础血糖值发生变化这说明睡莲花提取物组提前2周的药物调理对机体产生了某些影响，而其峰值的降低以及快速的下调体内高血糖则说明其机体对血糖的吸收有所抑制，同时血糖调节能力也得到了一定的优化，虽然尚不清楚其具体降糖机制，但是结合其良好的体外降糖作用，可以推测睡莲花提取物具有较好的降糖潜力。