微流控芯片法在非洲猪瘟病毒核酸快速检测中的性能分析

邵靓，陈弟诗*，陈斌，卢先东，邓飞，张毅，刘艳红，周莉媛，李丽

(1. 四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041；2. 宁波爱基因科技有限公司，浙江 宁波 315100)

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，发病率和死亡率可达100%。目前尚无有效疫苗。被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告疫病，被我国列为一类传染病[1-2]。到目前为止，我国共发生非洲猪瘟疫情190余起，覆盖全国31个省份。根据非洲猪瘟防控新形势，农业农村部正在逐步建立常态化防控机制。当前，各养殖企业、屠宰场、无害化处理场等场所，以及各级兽医主管部门、动物疫病防控和卫生监督机构等都在广泛开展非洲猪瘟实验室检测，亟需大量敏感、快速、操作简便的检测试剂。

微流控芯片技术是通过生物学、化学、医学、电子、材料、机械等多学科交叉，将样品前处理、分离及检测等过程集成到几平方厘米的芯片上，从而实现分析的微型化、自动化、集成化和便携化的技术，具有样品消耗少、检测速度快、操作简便、多功能集成、体积小和便于携带等优点，极大地拓展了体外诊断的应用空间，已在分子生物学、化学分析、医学等多个领域得到应用[3-5]。本研究评估了微流控芯片法在ASFV核酸快速检测中的各项性能，并和市场上的ASFV荧光定量PCR检测试剂盒进行比对分析，为ASF的快速检测提供了新手段，也为我省ASF的防控提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

磁珠法核酸提取试剂盒购自天隆生物科技有限公司；明日达ASFV微流控芯片快速检测试剂盒由宁波爱基因科技有限公司提供；ASFV荧光定量PCR检测试剂盒购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司。

1.2 样品

ASFV VP72质粒标准物质由中国动物疫病预防控制中心提供。

猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和伪狂犬病毒(PRV)培养物由四川省动物疫病预防控制中心提供。

ASFV临床样品为采集自四川养殖场、屠宰场的猪全血、口鼻拭子、环境拭子，共43份。

1.3 病毒核酸提取

按照磁珠法核酸提取试剂盒说明书提取各检测样本核酸，置于-20 ℃保存备用。

1.4 微流控芯片检测系统

本研究采用了预埋好特异性扩增引物的微流控芯片(如图1A)，扩增靶基因为ASFV VP72。芯片由4个独立单元构成，每个单元由2个加样孔和8个反应槽构成，每个加样孔与 4个反应槽相连，但加样孔之间以及反应槽之间不连通。将核酸和反应液混匀后加入加样孔，用透明膜密封加样孔，利用离心力定向驱动样本流动进入反应池(图1B，绿色部分所示)，样本可以均匀分配到4个反应孔；放入微流控芯片检测仪恒温扩增(如图1C)；经过实时荧光读取，信号输出，呈现结果。当待检样品在30 min内扩增出特异性曲线，判为ASFV核酸阳性；当待检样品在30 min内未扩增出特异性曲线，判为ASFV核酸阴性。

A. 微流控芯片；B. 微流控芯片的加样孔、微通道和检测孔结构；C. 微流控恒温扩增仪

1.5 敏感性试验

将ASFV VP72质粒标准物质进行梯度稀释后，用ASFV微流控芯片法检测，分析该方法的敏感性，并与荧光定量PCR结果进行比较。

1.6 特异性试验

采用CSFV、PEDV、TGEV、PCV2、PRV培养物样本，分析ASFV微流控芯片特异性，ASFV VP72质粒标准物质作为阳性对照。

1.7 重复性试验

用稀释到2.5和5×101copies/μL的ASFV VP72质粒标准物质作为重复性测试试验的样本，用微流控芯片法和荧光定量PCR法同时进行检测，重复8次。计算微流控芯片测得的2种浓度样本CV值，评估该方法的重复性。

1.8 临床样本检测

收集43份临床样本，采用微流控芯片法进行检测，并与荧光定量PCR法进行对比，分析结果，并计算符合率。

2 结果

2.1 ASFV微流控芯片敏感性

采用梯度稀释的ASFV VP72质粒标准物质(5×103、5×102、5×101、25、5、2.5、1.0、0.5、0.05 copies/μL)，分析ASFV微流控芯片的检测敏感性，结果如图2、表1所示，微流控芯片的最低检出限是2.5 copies/μL，与市场上商品化的荧光定量PCR试剂盒的敏感性一致。

1～9. 分别为5×103、5×102、5×101、25、5、2.5、1.0、0.5和0.05 copies/μL

2.2 ASFV微流控芯片特异性

如图3所示，除阳性对照出现明显“S型”扩增曲线外，其他样本检测结果均为阴性，表明该ASFV微流控芯片与其他病原无交叉反应，特异性良好。

2.3 ASFV微流控芯片重复性

用稀释到2.5 copies/μL的ASFV VP72质粒标准物质作为重复性测试试验样本时，3次阳性，5次阴性(图4A、表2)，微流控芯片法和荧光定量PCR法结果一致；用稀释到5×101copies/μL的ASFV VP72质粒标准物质作为重复性测试试验样本时，8次结果均为阳性(图4B、表2)，微流控芯片法和荧光定量PCR法结果一致。计算微流控芯片测得的2种浓度样本CV值，结果表明2.5 copies/μL的测试样本和5×101copies/μL的测试样本的CV值分别为2.1%和2.2%(表3)，重复性良好。

表1 ASFV微流控芯片与荧光定量PCR敏感性测试结果

1. ASFV VP72质粒标准物质；2～6. 分别为CSFV、PEDV、TGEV、PCV2、PRV培养物

A. 标准物质浓度2.5 copies/μL；B. 标准物质浓度5×101 copies/μL

表2 ASFV微流控芯片与荧光定量PCR重复性测试结果

表3 ASFV微流控芯片检测重复性的CV值

2.4 临床样本检测分析

如表4所示，微流控芯片法与荧光定量PCR法对43份临床样品的检测阳性率分别为检测结果符合率为97.67%(42/43)，不符合的1份样本为环境拭子样品，荧光定量PCR法检测为阴性，而微流控芯片法为阳性。

表4 微流控芯片与荧光定量PCR对临床样本的检测

3 讨论

荧光定量PCR是目前生产实践中用于检测ASFV最常见的一类方法。与常规PCR相比，具有快速、敏感的特点，最低检出限可达几个到几十个病毒拷贝。尽管如此，荧光定量PCR反应需在不同的温度区循环，对仪器要求高；微量加样步骤多，对操作专业要求高；出结果时间较久；且成本也相对高昂。环介导等温扩增(LAMP)方法由日本学者Notomi等[6]发明，是一种核酸恒温扩增技术，只需水浴锅或恒温箱等简单设备即能开展实验，并通过在反应体系中加入特殊物质使得反应结果肉眼可见，具有灵敏度高、操作简单、反应时间短、临床使用不需要特殊仪器等优点，特别适合在现场和基层部门应用。从目前国内学者建立的ASFV的LAMP检测方法来看，该方法具有较高的核酸检测敏感性以及良好的特异性[7-8]。ASFV微流控芯片检测是在已有的LAMP扩增基础上结合Exo-NAT技术的一种新的恒温扩増技术，扩增时间仅需要30 min，同时敏感性提高了3～4倍，近年来得到许多研究者的青睐[9]。

本次试验运用微流控芯片法和荧光定量PCR法对ASFV标准物质、临床样本和其他病毒培养物样本进行检测，结果表明微流控芯片检测方法的敏感性、重复性和特异性等性能不低于荧光定量PCR方法，符合对ASFV诊断的要求。在敏感性方法，ASFV微流控芯片法可实现2.5 copies/μL的最低检出限；在特异性方面，该方法对CSFV、PEDV、TGEV、PCV2和PRV等5种病毒培养物均未出现交叉反应；同时，该方法具有良好的检测重复性；运用该方法与荧光定量PCR法对临床样本进行检测，检测结果符合率为97.67%，不符合的一份样本检测结果荧光定量PCR法为阴性，而微流控芯片法为阳性，提示微流控芯片法可能具有更高的检出率。此外，由于ASFV微流控芯片法检测时间短，不需要温度循环，检测仪便于携带和运输等特点，特别适合于现场快速检测和基层部门应用。

本次试验仅对ASFV微流控芯片快速检测试剂盒及ASFV荧光定量PCR检测试剂盒的某一批号做了简要比较分析，如有条件，需扩大样本量，进一步验证ASFV微流控芯片快速检测试剂盒的各项性能，为政府监管部门、食品生产企业、畜牧水产养殖企业的相关病原体检测及监控提供有力工具。同时，随着微流控和基因芯片等新技术开始不断应用于动物疫病检测领域，未来ASFV病原学检测将更加快速、准确及自动化，必会进一步为ASF防控提供有效支持。