葛根素对镉致大鼠肾脏病理变化和皮质氧化损伤的保护效应

徐明畅，闻双全，王莉，张文华，邹辉，顾建红，刘学忠，卞建春，刘宗平，袁燕*

(1.扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009；2.江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009)

镉(cadmium, Cd)为一种重金属元素，镉对动物及人体危害较大，可引起呼吸系统、骨骼、泌尿系统、血液循环系统等的严重损伤。20世纪40年代以来，镉随着其他金属的开采而释放进入环境中，工业的发展也使镉的排放量愈发增加[1]。直至现在，重金属镉在大气、饮水、土壤等环境中的蓄积量剧增，加之其生物蓄积性强、蓄积时间持久的特性，导致镉对人体及动物体的危害已成为令人棘手的问题。镉对人畜机体的危害可通过其对各组织脏器的损伤来实现，其中包括对肝、肾、脑、睾丸、骨骼等的损伤作用。镉进入机体后迅速分布于各组织脏器，其中绝大多数进入肝脏和肾脏[2]。肾脏是镉慢性毒性的靶器官，镉在肾脏中的半衰期最多能达到30年[3]。镉能造成近端肾小管和肾小球的损伤，使其对尿液的重吸收下降，引起低分子量蛋白尿症、氨基酸尿症、碳酸氢盐尿症、糖尿病等[3]。体外试验表明，镉致使肾小管上皮细胞活性氧(ROS)水平升高，在体内大量聚积从而造成氧化损伤[4]。

葛根素(puerarin, Pur)又称葛根黄素，为一种单体化合物，化学名为4,7-二羟基8-β-D吡喃葡萄糖醛基异黄酮，相对分子质量416。葛根素的药理学应用包括抵抗心律失常、降血压、舒张血管、增加脑血流量、保护神经细胞、改善血脂水平、治疗糖尿病、降低眼压和解酒等[5]。葛根素对肾脏具有保护效应，这体现在能降低过高的血糖[6]，改善肾小球滤过功能和代谢紊乱等[7]。目前有研究指出葛根素能降低镉致肾上皮细胞和血清中的ROS升高，并提高机体抗氧化能力、减少肾脏内脂质过氧化的生成与蓄积，保护肾脏免受过氧化损伤[8]。然而，葛根素对于镉造成的肾脏损伤的作用尚未阐明。因此，本试验旨在通过体内试验，研究镉暴露对大鼠肾脏的毒性损伤作用和葛根素的保护效应，为临床上葛根素防治镉暴露引起的肾脏损伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只，体重(70±5)g，由江苏大学比较医学中心提供。

1.2 主要试剂

葛根素(Sigma, USA)；醋酸镉(CdAc2, 国产分析纯)；羧甲基纤维素钠(索莱宝科技有限公司)；丙二醛(MDA)、还原性谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；BCA蛋白质量浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；标准蛋白(新赛美生物科技有限公司)。

1.3 动物分组与处理

将36只SD雄性大鼠于安静清洁干燥的室温(22±2)℃环境中预饲养21 d，预饲养后称重并将其随机分为4组，分别为对照组(Con)、镉组(Cd)、葛根素组(Pur)、镉与葛根素共处理组(Cd+Pur)。葛根素组、镉与葛根素共处理组每天灌胃葛根素200 mg/kg体重(用0.5%羧甲基纤维素钠溶解)，其他组灌胃相同剂量的0.5%羧甲基纤维素钠，灌胃14 d后，在灌胃的同时，镉组、镉与葛根素共处理组用50 mg/L镉自由饮水。处理90 d后，称重，每只大鼠按60 mg/kg体重的剂量肌肉注射戊巴比妥钠麻醉，断颈处死大鼠，分离完整肾脏。肾脏分离背膜，从肾脏剥离出皮质并剪碎，放入冻存管中，置-80 ℃冰箱，待用。

1.4 病理切片制作与HE染色

将分离的完整肾脏在固定液中浸泡24 h，取出后用手术刀进行切割，使用脱水机梯度酒精脱水、二甲苯透明，石蜡浸泡并包埋。用切片机切片后滴加30%酒精，后移入40 ℃恒温水浴使其完全展开，再贴附于载玻片上，并经烤片机烘干。经二甲苯脱蜡、蒸馏水漂洗后，分别用苏木素染色、盐酸酒精分色、自来水冲洗、氨水返蓝、伊红染色、酒精脱色脱水、二甲苯透明，最后用中性树胶封片，在光学显微镜下观察(日本尼康公司)。

1.5 测定氧化损伤相关指标

测定肾脏皮质内GSH、MDA含量和GSH-Px、SOD、CAT活性，根据南京建成生物工程研究所检测试剂盒的说明书进行操作。

1.6 数据分析

运用数据分析软件SPSS 24.0对检测结果进行显著性t检验和单因素方差(ANOVA)统计分析，结果以“平均数±标准差”表示。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 肾脏病理组织学观察

对照组(图1A)和葛根素组(图1B)大鼠肾组织染色均匀，肾小球形态结构未见明显异常；镉组(图1C)大鼠肾组织可见较多肾小管上皮细胞颗粒变性(黑色箭头)，胞质疏松淡染，可见刷状缘脱落(蓝色箭头)，少数血管周围可见较多炎性细胞浸润(红色箭头)；与镉组相比，镉与葛根素共处理组(图1D)病变有所减轻，肾小球形态结构未见明显异常，局部可见少量肾小管上皮细胞颗粒变性(黑色箭头)、胞质疏松淡染、刷状缘脱落(蓝色箭头)。

A. Con组；B. Pur组；C. Cd组；D. (Cd+Pur)组

2.2 镉与葛根素对大鼠肾脏皮质内MDA含量的影响

如图2所示，与对照组相比，镉组肾皮质中MDA含量极显著升高(P<0.01)；与镉组相比，镉与葛根素共处理组MDA含量极显著降低(P<0.01)；对照组、葛根素组与共处理组之间MDA含量无显著差异(P>0.05)。

2.3 镉与葛根素对大鼠肾脏皮质内SOD活性的影响

如图3所示，与对照组相比，镉组肾皮质SOD活性显著降低(P<0.05)；与镉组相比，镉与葛根素共处理组SOD活性显著升高(P<0.05)；对照组、葛根素组与共处理组之间SOD活性无显著差异(P>0.05)。

注：大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，字母相同表示差异不显著(P>0.05)。下同

图3 大鼠肾皮质中SOD活性变化

2.4 镉与葛根素对大鼠肾脏皮质内CAT活性的影响

如图4所示，与对照组相比，镉组肾皮质中CAT活性显著降低(P<0.05)；与镉组相比，镉与葛根素共处理组CAT活性显著升高(P<0.05)；对照组、葛根素组与共处理组之间CAT活性无显著差异(P>0.05)。

图4 大鼠肾皮质中CAT活性变化

2.5 镉与葛根素对大鼠肾脏皮质内GSH-Px活性的影响

如图5所示，与对照组相比，镉组肾皮质中GSH-Px活性极显著降低(P<0.01)；与镉组相比，镉与葛根素共处理组GSH-Px活性极显著升高(P<0.01)；对照组、葛根素组与共处理组之间GSH-Px活性无显著差异(P>0.05)。

图5 大鼠肾皮质中GSH-Px活性变化

2.6 镉与葛根素对大鼠肾脏皮质内GSH含量的影响

如图6所示，与对照组相比，镉组肾皮质中GSH含量极显著升高(P<0.01)；与镉组相比，镉与葛根素共处理组GSH含量显著降低(P<0.05)；对照组、葛根素组与共处理组之间GSH含量无显著差异(P>0.05)。

图6 大鼠肾皮质中GSH含量变化

3 讨论

镉为环境中常见的重金属之一，可造成环境的污染，并进一步引起动物和人的健康问题。镉对各组织器官均有不同程度的毒性作用，其中，肾脏可能为最敏感和重要的器官之一[9]。为了模拟“环境暴露”与“职业暴露”的镉污染状况，有学者分别以5 mg/L 和50 mg/L镉饮水浓度建立了大鼠模型[10-11]。此外，研究表明50 mg/L镉自由饮水能造成大鼠大脑、肝脏、睾丸等部位的毒性损伤[12-14]。因此本试验选用50 mg/L镉自由饮水的方式探究镉对肾脏的毒性损伤作用。本试验中肾脏病理切片结果显示，镉组部分肾小管上皮细胞出现颗粒变性，胞质疏松淡染，核淡染，微绒毛围成的刷状缘部分脱落，少数血管周围可见多种炎性细胞浸润，说明重金属镉造成了肾脏一定程度的病理损伤。

氧化应激为镉肾脏毒性的重要机制之一，且为镉致肾脏损伤的主要原因[15]。脂质过氧化为氧化应激产生的活性氧自由基与生物膜上的多不饱和脂肪酸发生氧化反应，生成具有毒性的过氧化物的过程，其产生的二级产物包含多种醛酸，MDA包括在内，且为整个过程中致突变性最强的一个[16]，故为氧化应激和脂质过氧化过程的重要生物标志。本试验中，镉组MDA相比于对照组，含量极显著升高，表明镉造成了肾脏皮质的氧化应激和脂质过氧化。

葛根素为一种由豆科植物野葛、甘葛的根中提取出来的中药材，中医认为其有升阳、活血、通络的作用，因此对人体心脑血管系统有很多积极影响。葛根素药理作用强、安全范围广，现已在临床被广泛运用，包括在糖尿病早期降低疾病对肾功能的损害[26]。研究表明，200 mg/kg葛根素能有效逆转各种原因导致的大鼠各脏器病理损伤[27-28]，因此本研究选用此剂量用以探究葛根素对镉造成肾脏毒性损伤的保护作用。本研究的病理切片结果显示，葛根素缓解了镉造成的肾脏病理损伤：肾上皮细胞见有少量颗粒变性，刷状缘脱落程度不大，未见明显的炎性细胞浸润。许多研究发现葛根素能降低不同原因所致的肾脏氧化损伤，如铝造成的脂质过氧化作用[29]、肾脏组织细胞缺血再灌注引起的氧化应激[30]等。龙梦菲等[8]研究发现葛根素能降低镉造成的血清中MDA含量的升高和SOD、总抗氧化能力(T-AOC)活性的下降。本研究发现，葛根素能抑制镉引起的肾皮质中MDA、GSH含量升高，GSH-Px、SOD和CAT活性降低，说明天然抗氧化剂葛根素能在一定程度上减轻重金属镉对肾脏造成的氧化应激，提高机体的抗应激水平。

综上，本研究表明，镉暴露能导致肾脏发生一定的病理变化，并能引起肾皮质中MDA、GSH含量升高，SOD、CAT和 GSH-Px活性降低，导致肾脏氧化损伤；葛根素对镉造成的肾脏毒性具有一定的保护作用。