甜菜碱对藏鸡脂肪代谢及其相关基因表达的影响

姚宏,郑玉才,李志雄,谈永萍,王云浩，陈宇星,徐亚欧，向方成，饶开晴*

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041;2.成都美丽田园农业公司，四川 彭州 611930)

甜菜碱(三甲铵乙内脂)广泛存在于动植物中，具有无毒、无害、无残留的优点，且有较强的抗氧化性能[1]。自芬兰科学家发现甜菜碱具有独特的诱食功能后，其在水生动物中被广泛应用[2]。研究发现，甜菜碱不仅具有提供甲基、调节体内脂肪代谢、缓解应激、调节渗透压等功能[3-4]，还能提高肉鸡的生长性能[5-6],降低肉鸡腹脂率并提高其胴体品质[7]，改善体内脂肪代谢、促进磷脂和载脂蛋白合成的功能，它是一种新的营养再分配剂[8]。甜菜碱通过提供肉碱合成所必须的甲基从而提高生长育肥猪肝脏游离肉碱的含量，促进长链脂肪酸进入肌肉线粒体进行β-氧化，减少皮下脂肪含量，同时增加肌肉脂肪含量，发挥体脂重新分配的作用[1]。研究表明，甜菜碱减少脂肪沉积的机理主要是通过为蛋氨酸的合成以及为脂肪的代谢提供甲基、参与卵磷脂合成、促进肝脂迁移，降低肝脏和血清中甘油三酯的含量；其次，甜菜碱通过促进肌肉和肝脏中肉碱的合成提高线粒体中脂肪的氧化，从而减少畜禽体内脂肪的沉积[9-11]。

藏鸡觅食能力强，耐粗放，是我国高寒、低压及缺氧高海拔地区养禽业的重要品种资源[12]。但由于藏鸡繁殖力弱，产蛋量低制约着藏鸡的开发利用。鸡蛋形成过程中，卵黄的生成需要大量的脂质沉积。我们之前的研究已经发现饲粮中添加甜菜碱能提高藏鸡产蛋率，以及提高蛋黄中粗脂肪的含量[13]，这与脂肪代谢的改变有着密切的关系。甜菜碱可能通过影响藏鸡肝脏脂肪代谢，降低体内脂肪沉积，进而促进蛋内脂肪沉积，改善藏鸡的产蛋性能。

目前关于甜菜碱调节动物脂肪代谢的研究多集中于猪、肉鸡[14-18]，但关于藏鸡饲粮中添加甜菜碱能否通过促进脂肪酸β-氧化，调控藏鸡肝脏上脂蛋白脂肪酶(liportein lipase，LPL)、乙酰辅酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)以及过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARα)等关键基因的表达，从而影响藏鸡体脂沉积尚未见报道。因此，本试验拟研究饲粮中添加不同水平甜菜碱对藏鸡脂肪代谢及其相关基因表达的影响，从而为甜菜碱作为添加剂在藏鸡饲粮中更科学地应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计和饲养管理

选择体重相近的180只30周龄藏鸡，随机分为3组，每组6个重复，每个重复10只。参照《中国饲料成分及营养价值表》(第26版)配制玉米-豆粕型基础饲粮(表1)，对照组饲喂基础饲粮，试验组分别在基础饲粮中添加1 000 mg/kg(低剂量组)和3 000 mg/kg(高剂量组)的甜菜碱(纯度为98%，购于天石生物有限公司)。试验在四川彭州市丛林藏鸡种鸡场进行，采用笼养，每笼2～3只。饲养全期为56 d，前期1～7 d为预饲期，后期8～56 d为试验期，建立严格的饲养管理制度。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.2 样品采集

饲养56 d后每个重复选取2只藏鸡，颈静脉采集血液于离心管内，经4 000 r/min离心10 min，分离血浆，置于-20 ℃冰箱中保存。采血后屠宰，分离肝脏，液氮速冻后于-80 ℃保存。

1.3 检测指标和测定方法

1.3.1 生产性能的测定

于试验第1、56天以重复为单位称藏鸡空腹体质量，每天记录藏鸡饲料消耗量，用于计算其平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.3.2 腹脂率的测定

打开腹腔分离腹部脂肪，脂肪重量由电子天平测量，腹脂率(%)=腹脂重/活体重×100%。

1.3.3 血脂及肝脂含量的测定

利用ELx800酶标仪(BioTek)使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒检测肝脏、血浆中甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)含量和血浆中高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoproteins,HDL-C)以及低密度脂蛋白胆固醇(low-dendity lipoproteins, LDL-C)、游离脂肪酸(non-esterified fatty acid,NEFA)含量，具体方法参照试剂盒说明书。

1.3.4 肝脏中ACC、FAS、PPARα和LPL基因表达的测定

采用TRIzol试剂(Invitrogen公司)提取肝脏组织总RNA，反转录酶(TaKaRa公司)进行反转录获得cDNA，-20 ℃冰箱保存备用。引物由金唯智生物有限公司合成，引物信息见表2。以上述cDNA为模版，进行实时荧光定量PCR(qPCR)分析，使用TaKaRa(大连宝成生物有限公司)的TB Green TM PremixExTaqTMⅡ(Til RNase Plus)试剂盒建议的反应体系，混合反应物，总体积为10 μL，利用荧光定量PCR仪(Thermo Fisher Scientific-Q3)进行扩增，qPCR反应采用两步法，反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，退火30 s，循环40次，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

表2 实时荧光定量PCR引物序列

1.4 数据统计与分析

使用SPSS(18.0)统计软件中单一方差分析对生产性能、腹脂率、TG、TC、LDL-C、HDL-C和NEFA进行统计学分析；用2-ΔΔCt法对基因做相对定量表达分析，基因数据先进行正态性检验，如果数据不服从正态分布，统计分析前需要用Log10进行数据转化，再用单一方差分析对转化后的数据进行统计学处理，所有数值以“平均值±标准误”表示。P>0.05表示无显著差异，P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 甜菜碱对藏鸡生产性能的影响

由表3可见，甜菜碱添加对藏鸡的平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)、料重比(F/G)以及终末重均无显著影响(P>0.05)。

表3 甜菜碱对藏鸡生产性能的影响

2.2 甜菜碱对藏鸡腹脂率的影响

与对照组相比，饲粮中添加1 000 mg/kg和3 000 mg/kg的甜菜碱均显著降低了藏鸡腹脂率(P<0.05)，且高剂量组腹脂率显著低于低剂量组(P<0.05)。见图1。

2.3 甜菜碱对藏鸡血浆及肝脏中脂类相关指标含量的影响

与对照组相比，低、高剂量试验组藏鸡肝脏和血浆中TG(图2A)、TC(图2B)的含量均显著降低(P<0.05)，且高剂量组肝脏中TG和TC的含量显著低于低剂量组(P<0.05)；2个试验组藏鸡血浆中LDL-C含量(图2C)显著降低(P<0.05)，但低、高剂量组之间没有显著差异(P>0.05)；高剂量组血浆中HDL-C含量(图2D)较对照组显著增加(P<0.05)，而低剂量的甜菜碱对藏鸡血浆中HDL-C含量没有显著影响(P>0.05)，不同添加水平之间也无显著差异(P>0.05)；甜菜碱提高了藏鸡血浆中NEFA含量(图2E)，且呈现剂量效应(P<0.05)。

注：相同字母或无字母为差异不显著(P>0.05)，不同字母为差异显著(P<0.05)。下同

A. TG; B. TC; C. LDL-C; D. HDL-C; E. NEFA

2.4 甜菜碱对藏鸡肝脏中脂肪代谢关键基因表达的影响

与对照组相比，高剂量组甜菜碱显著降低了藏鸡肝脏中ACC基因表达量(P<0.05)(图3A)；低剂量组与高剂量组均显著降低了藏鸡肝脏中FAS基因表达量(P<0.05)，但低剂量组与高剂量组间没有显著差异(P>0.05)(图3B)；甜菜碱的添加显著上调了藏鸡肝脏中PPARα基因的表达且有剂量效应(P<0.05)(图3C)；LPL基因的表达量在各组间均没有显著差异(P>0.05)(图3D)。

A. ACC; B. FAS;C. PPARα; D. LPL

3 讨论

目前，甜菜碱对藏鸡生产性能影响的研究除了本实验室外尚未见其他的研究报道。胡旭进等[18]研究表明，饲粮中添加甜菜碱能提高金华猪的ADG。本试验研究结果表明，饲粮中添加甜菜碱对藏鸡ADG、ADFI、F/G以及终末重均无显著影响，这可能与藏鸡对饲料的转化率以及独特的生存环境有关。

肉鸡腹部相对于其他部位是脂肪沉积最快的地方[19]，腹脂是评判机体脂肪沉积的关键指标，因其在体脂中占较大比例，直接影响体脂沉积量[20]。本试验中，甜菜碱降低了藏鸡腹脂率，这与Saunderson等[21]报道的甜菜碱显著降低肉鸡腹脂沉积的结果较一致。Wang等[22]研究也发现甜菜碱显著降低了肉鸭腹脂沉积，而且高剂量的甜菜碱减少腹部脂肪沉积效果更佳。

血清中血脂含量(TC、TG、LDL-C、HDL-C、NEFA等)可反映机体总体脂代谢状况，如血清中TG、TC含量降低，NEFA含量升高，表明机体脂肪分解增强，合成减弱[23]。本试验中，甜菜碱降低了藏鸡血浆中TC、TG、LDL-C含量，增加了藏鸡血浆中NEFA含量，这与马建爽等[24]、张冬梅等[25]的报道一致，且在本试验中高剂量甜菜碱的添加效果更加明显。甜菜碱通过自身代谢循环，促进动物体内磷脂的合成，促进肝脏中载脂蛋白的合成，使TG的迁移速度加快，降低了血清TG的含量[26]。本试验中高剂量的甜菜碱组中血浆HDL-C含量升高，说明血液运输胆固醇的能力增加，使血浆TC含量下降，这表明甜菜碱能够影响肝脏的脂质代谢，从而改变脂蛋白的比例，起到降低或重新分配体内脂肪的作用。

FAS是组织脂肪酸合成的关键酶[27], 能直接控制机体脂肪合成，其在肝脏中的活性可作为评判脂肪合成能力的关键指标，且FAS活性与其基因mRNA表达量相关[28-29]。本试验中，高、低剂量甜菜碱均降低了肝脏中FAS基因的表达量，与Xing等[14]和Huang等[15]在日粮中添加甜菜碱降低肉鸡和猪肝脏中FAS基因表达的研究结果一致。FAS基因表达降低，表明肝脏脂肪合成代谢减弱，证实了添加甜菜碱降低肝脏脂肪合成的能力。同时FAS基因表达下调可降低脂肪酸脂化生成TG，进一步降低TG在脂肪组织中沉积的效率[30]。因此，在饲料中添加甜菜碱减少了藏鸡腹脂沉积及降低其血浆TG含量与其下调了藏鸡肝脏中FAS基因的表达密切相关。

动物体脂沉积所需的脂肪酸大多数来自自身的脂肪酸合成，由脂肪酸合成酶催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成脂肪酸。ACC可以催化乙酰辅酶A生成丙二酸单酰辅酶A的羧化作用，是长链脂肪酸从头合成的限速酶[31]。ACC既是脂肪酸合成的关键酶又是限速酶，是脂肪酸合成与代谢中起重要作用的中间代谢物，是大多数生物脂肪酸从头合成的第一个必需酶[32]。本研究结果显示，藏鸡饲料中添加3 000 mg/kg甜菜碱后，肝脏组织中ACC基因表达量显著下降，说明高剂量的甜菜碱可在转录水平上通过抑制肝脏脂肪合成从而控制腹脂沉积，与腹脂率显著减少的结果是相一致的。

PPARα是调节线粒体脂肪酸β-氧化基因的主要转录因子[33]，能在心、肝、肌肉和肾脏中表达，调节脂肪的分解代谢[34]。本研究中饲粮添加低、高剂量的甜菜碱均显著上调了藏鸡肝脏中PPARα基因的表达，这与冷智贤[35]报道甜菜碱增加了肉鸡肝脏中PPARα基因表达量结果一致。因此，甜菜碱可能通过提高机体线粒体脂肪酸β-氧化来调节脂肪代谢。

LPL主要是由脂肪组织和骨骼肌细胞合成分泌，它是催化脂肪组织中TG代谢的限速酶[36]，在脂蛋白代谢中起着重要作用[37]。它通过将乳糜微粒和极低密度脂蛋白中的三酰甘油分解成脂肪酸和甘油，储存在脂肪组织中，在不同营养或生理状态下根据组织的代谢需要来指导脂肪酸导入特异部位[38]。本试验中，高、低剂量甜菜碱的添加对藏鸡肝脏中LPL基因表达没有影响，这可能与甜菜碱的作用时间以及藏鸡的发育阶段等有关，还有待进一步研究。

综上所述，饲粮中添加高、低剂量的甜菜碱，均能减少藏鸡腹脂沉积，这可能与甜菜碱显著下调肝脏中FAS基因、上调肝脏中PPARα基因的表达，从而显著降低藏鸡血浆中TG、TC、LDL-C的含量和增加血浆中NEAF的含量有关。本试验中甜菜碱的添加能够通过抑制藏鸡脂肪合成，促进脂肪酸氧化来影响脂肪代谢，其中3 000 mg/kg甜菜碱添加效果更佳。