超高效液相色谱-串联质谱法测定化妆品中三氯生和三氯卡班

2021-07-08范晨丽李彦超申二永

食品与药品 2021年3期

范晨丽，李彦超，申二永

（河南省食品药品检验所，河南郑州 450008）

三氯生（triclosan，TCS）和三氯卡班（triclocarban，TCC）作为高效、安全的新型抗菌剂[1]，在日化产品[2]、洗涤剂、医疗消毒和卫生保健产品[3-5]中应用广泛。国内关于三氯生对人体是否存在致癌性仍有争议，尚无足够证据证实其对人体的致癌性，Zeng等[6]指出三氯生能诱导小鼠肝硬化，有肝肿瘤促进剂的作用和肝毒性效应，且与含氯的自来水发生反应形成氯仿。三氯卡班能引起人体肝细胞DNA 损伤[7]，是种新型的内分泌干扰素[8]。

目前，化妆品中三氯生和三氯卡班的检测方法为高效液相色谱法[9-10]，气相色谱法[11]，气相色谱-质谱联用法[12]和高效液相色谱-串联质谱法[13-14]等；气相和气相-质谱联用操作繁琐，高效液相色谱法是目前最广泛采用的方法。但化妆品基质复杂，干扰物质多，易造成假阳性结果。液相色谱-质谱联用技术日益增强，专属性强，可实现多种组分结构确认，大大提高待测化合物筛查的准确度。

本研究总结发现2015年版《化妆品安全技术规范》[15]里针对于三氯卡班的第一方法为液相色谱法，而三氯生未被纳入规范。一些检测机构采用行业标准SN/T 1786-2006（进出口化妆品中三氯生和三氯卡班的测定）中液相色谱法进行检测。少有文献研究化妆品中用超高效液相-串联质谱同时测定三氯生和三氯卡班的方法。本文在优化前处理的基础上，基于超高效液相-串联质谱技术建立了高灵敏度、易操作的化妆品中三氯生和三氯卡班的分析方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQD超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（ESI 源）（美国Waters 公司）；KQ5200DE型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；IKAMS3 basic旋混合器（上海珂淮仪器有限公司）；XP-105型分析天平（梅特勒-托利多公司）；3-30K型离心机（德国Sigma公司）；MILLI-Q Advantage型纯水机（法国默克密理博公司）。

1.2 材料

1.2.1 对照品和试剂三氯生（批号TC190617-02，Stanford Chemicals，纯度99.8 %）；三氯卡班（批号TC180821-10，Stanford Chemicals，纯度99.8 %）；试剂：甲醇（色谱纯，德国默克）；超纯水（自制）。

1.2.2 实际样品样品均采购自郑州某大型超市：防晒类化妆品9批，均乳状；祛痘类9批（其中3批3水基状、3批乳状、3批霜状）婴幼儿类8批（其中4批乳状、4批霜状）沐浴类4批（其中2批乳状、2批水基状）；阴性样品（即经检测不含三氯生和三氯卡班的婴幼儿类乳状样品）。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 色谱条件色谱柱为BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以水为流动相A，甲醇为流动相B，梯度洗脱，柱温 30 ℃，进样量2 μl。详见表1。

表1 高效液相色谱流动相及参考分离条件

2.1.2 质谱条件电离方式为ESI（-）；毛细管电压2.5 kV；离子源温度 150 ℃；脱溶剂气温度 300 ℃；脱溶剂气流量 600 L/hr；碰撞气为氩气；检测方式为多反应监测（MRM）。三氯生和三氯卡班的质谱测定参数见表2。

表2 三氯生和三氯卡班的质谱测定参数

2.1.3 液态水基类、膏霜乳液类样品前处理准确称取样品约0.5 g（精确至0.0001 g）置入25 ml具塞比色管，甲醇定容至刻度，超声振荡20～30 min使样品完全分散（如有无法分散的样品可50～60 ℃水浴约2～3 min即可溶解）。6000 r/min离心10 min。如需稀释，则取上清用甲醇适当稀释，经0.22 μm滤膜过滤至棕色（防止见光分解）进样瓶中作为待测溶液。

2.1.4 固体皂类样品前处理从中切开样品，刮取断面样品（碎末状），准确称取约0.5 g（精确至0.0001 g）置入25 ml具塞比色管，先加入丙酮10 ml，涡旋2 min，使样品完全分散（如有无法分散的样品需50～60 ℃水浴约2～3 min即可溶解）。超声振荡20～30 min后，用甲醇定容至刻度，于6000 r/min离心10 min。如需稀释，则取上清用甲醇适当稀释， 0.22 μm滤膜过滤至棕色进样瓶中作为待测溶液。

2.1.5 标准溶液配制准确称取三氯生和三氯卡班对照品各10 mg分别置入10 ml量瓶，用甲醇定容至刻度，配制成1 mg/ml标准储备液。精密吸取上述各溶液适量置入10 ml量瓶，用甲酸稀释，配制三氯生浓度为1 μg/ml 、三氯卡班浓度为10 μg/ml的混合标准溶液，于-18 ℃冷冻条件下保存备用。

基质标准系列溶液：准确称取阴性样品0.5 g（精确至0.001 g），精密吸取混合标准溶液2.5 ml，按照样品前处理方法得三氯生浓度为100 ng/ml和三氯卡班浓度为1 μg/ml基质混合标准溶液，再经适当甲醇稀释，获得三氯生和三氯卡班的基质混合标准系列溶液，其质量浓度分别为5，10，50，100，200，400，500 ng/ml和0.5，1，5，10，20，40，50 ng/ml。经0.22 μm滤膜过滤，备用。

2.2 结果

2.2.1 样品前处理的优化针对液态水基类、膏霜乳液类样品，前处理分别用甲醇、乙腈，甲醇-水（7:2）和乙腈-水（7:2）4种有机溶剂提取。结果表明，甲醇和甲醇-水（7:2）对样品基质的干扰小，且甲醇的回收率略高于甲醇-水（7:2）；而乙腈和乙腈-水（7:2）致使膏霜类的三氯卡班回收率略低。针对于固体皂类样品，因水溶性差、提取率低，处理样品前需用极性强的溶剂先溶解分散样品。于是分别选用四氢呋喃和丙酮先溶解分散样品，再用甲醇定容。结果表明，四氢呋喃处理的回收率略低于丙酮，且四氢呋喃有毒性，对仪器有腐蚀性。综上，本实验选中甲醇作为液态水基类、膏霜乳液类样品的提取溶剂，丙酮作为固体皂类样品前处理溶剂。

2.2.2 液质条件的优化采用正离子ESI（+）扫描模式和负离子ESI（-）扫描模式对三氯生和三氯卡班进行扫描，两者均在负离子ESI（-）扫描模式下响应度高，0.3 μg/ml标准混合溶液以20 μl/min的流速直接注入，在全扫描的方式下确定三氯生和三氯卡班的母离子，优化锥孔电压、毛细管电压、脱溶剂气流量等质谱参数，使母离子响应值最高。再用子离子模式确定各自的子离子，优化碰撞能量，使子离子的响应度达到最大，从而确定最优的质谱条件。响应度较高的两子离子，一个为定性离子，一个为定量离子。由于三氯生含有氯分子结构，通过全扫描分别有286.855和288.855为母离子。在子离子扫描时286.855和288.855的质量数35.0的响应度远高于以286.855为母离子、141.912和159.987为子离子的两组离子对的响应度。结果表明，三氯生的定性离子m/z288.855>34.989、定量离子m/z286.855>34.989；三氯卡班的定性离子m/z312.882>125.956、定量离子m/z312.882>159.85。

2.2.3 液相条件的优化由于乙腈洗脱能力强，基线分离较困难，因此分别以甲醇-水、甲醇-0.1 %甲酸溶液、甲醇-0.1 %乙酸溶液、甲醇-0.05 mol/L甲酸铵溶液、甲醇-0.05 mol/L乙酸铵溶液为流动相，对三氯生和三氯卡班进行洗脱。结果表明，三氯生和三氯卡班在负离子模式的响应度较高，甲醇-0.1 %甲酸溶液和甲醇-0.1 %乙酸溶液作为流动相在负离子模式下，甲酸和乙酸会抑制峰强度，响应度低且容易拖尾；甲醇-0.05 mol/L甲酸铵溶液和甲醇-0.05 mol/L乙酸铵溶液作为流动相虽有利于化合物电离，响应度增加，但铵盐需要大量冲洗柱子，耗时。实验结果表明，甲醇和水为流动相进行梯度洗脱，有利于目标物的洗脱，节约时间，可有效地满足实验要求。

2.2.4 方法的线性关系和定量限将不同质量浓度的三氯生和三氯卡班的基质混合标准系列溶液分别进样测定，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标进行线性回归，建立基质标准曲线。结果表明，两者分别在5 ～500，0.5 ～50 ng/ml范围内线性关系良好，相关系数均大于0.996。按照信噪比为S/N≥10计算定量限，三氯生和三氯卡班的定量限分别为0.5，0.01 μg/g。结果见表3。

图1 三氯生和三氯卡班混合标准溶液的MRM谱图

表3 三氯生和三氯卡班的线性范围和定量线

2.2.5 精密度和回收率试验采用阴性样品分别加入三氯生和三氯卡班的标准混合溶液，制成含三氯生加标水平为25，100，250 μg/g加标样品，含三氯卡班加标水平为 2.5，10，25 μg/g加标样品。每个浓度进行6次平行试验，进行回收率和精密度试验。结果表明，三氯生的回收率在96.8 % ～100.3 %之间、三氯卡班的回收率在92.8 % ～110.2 %之间。三氯生RSD在2.3 % ～8.8 %之间、三氯卡班的RSD在1.7 % ～4.5 %之间，三氯生和三氯卡班的精密度和回收率良好。见表4。