北虫草不同极性部位体外抗肿瘤活性研究

李万芳，宋 健，李 洁

（1. 山东协和学院，山东 济南 250109；2. 山东中医药大学，山东 济南 250355；3. 山东中医药大学中医学院，山东 济南 250355）

北虫草（Cordyceps militaris）是一种药食两用真菌。研究表明，北虫草主要含有虫草素、腺苷等多种核苷、虫草多糖、氨基酸和无机元素的化学成分。虫草素作为虫草主要活性组分之一，其抗肿瘤效果已较早被证实，可延长 S180 荷瘤小鼠的存活时间，对肿瘤生长有一定抑制作用[1]。药理研究表明，北虫草有抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、增强免疫、抑菌抗病毒等多种生理功能，但是北虫草有效部位的分离纯化困扰着产业化发展，因此开展北虫草抗肿瘤有效部位研究有重要意义。

本实验采用系统溶剂法，按照极性高低对北虫草进行依次提取，制备得到了水、正丁醇、乙酸乙酯和石油醚4个提取部位，以乳腺癌MCF-7细胞株、食管癌ECA-109细胞株和肺癌A549细胞株为研究对象，用MTT法观察4个部位对肿瘤细胞的影响，检测其对MCF-7细胞、ECA-109细胞和A549细胞的抑制作用，为探讨北虫草不同极性部位的抗肿瘤作用提供实验依据，为北虫草的进一步有效开发和应用提供参考。

1 仪器、试剂和细胞株

1.1 仪器

二氧化碳培养箱（BB16UV/BB5060UV，HERAEUS）；酶标仪（Multiskan MK3，Thermo Scientific）；立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX-50FBS，上海申安医疗器械厂）；超低温冰箱（U410-86型）（Thermo Scientific）；台式离心机（H3，Sigma）；双人单面净化工作台（SW-CJ-1C，苏州净化设备有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（101，上海鹏顺科学仪器有限公司）；水浴恒温振荡器（SHZ-82，金坛市医疗仪器厂）；倒置显微镜（XDS-1B，重庆光学仪器厂）；微量移液器（Gilson，Eppendorf）；细胞培养瓶（Corning）；96孔细胞培养板（Costar，USA）。

1.2 试剂

胎牛血清（以色列Bioind）；胰酶细胞消化液（碧云天）；二甲基亚砜（DMSO，美国Amersco公司）；甲基噻唑蓝（MTT，美国Amresco公司）；1640细胞培养基（Hyclone，赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司）；青霉素链霉素混合液双抗；注射用顺铂（齐鲁制药有限公司）。

1.3 材料

取北虫草粉末，置入烧瓶，加入6倍量的石油醚（60～90 ℃）浸泡过夜，超声提取2次，每次1 h，过滤，合并滤液，减压（60 ℃，0.1 MPa）回收溶剂，真空干燥（60 ℃，0.1 MPa），得黄色黏稠油状物石油醚提取部位备用；滤渣挥干溶剂，依次换用乙酸乙酯、正丁醇、蒸馏水等溶剂替换石油醚重复上述工艺步骤，制备北虫草不同极性部位，其中乙酸乙酯部位为棕黄色黏稠状，正丁醇和水提取部位均为棕褐色。

1.4 细胞株

乳腺癌MCF-7细胞株、食管癌ECA-109细胞株、肺癌A549细胞株（山东省立医院）。

2 方法与结果

2.1 北虫草不同极性部位的制备

精密称取“1.3”项各提取部位，分别配制质量浓度为1，10，50，100 μg/ml样品液，待用。

2.2 细胞接种及培养

采用贴壁培养法，当肿瘤细胞生长至80 %融合时，消化制成单细胞悬液，接种于96孔板中，置入二氧化碳培养箱中培养。调零孔不加肿瘤细胞，调零组和空白对照组分别加入100 μl不含血清的1640培养基，阳性对照组加入10 μg/ml顺铂，其他给药组每孔分别加入含筛选药物终浓度依次为1，10，50，100 μg/ml的1640培养基100 μl。将细胞置入二氧化碳培养箱中继续培养24 h。

2.3 细胞存活率的测定

采用MTT法检测北虫草不同极性提取部位对乳腺癌MCF-7细胞、食管癌ECA-109细胞、肺癌A549细胞的生长抑制作用。

向每孔中加入MTT溶液，继续培养4 h。取出96孔板，吸去孔内上清，每孔分别加入DMSO 100 μl，放入酶标仪中并于490 nm波长处测定各孔的光密度值（OD值）。

按如下公式计算细胞存活率：

2.4 统计学分析

使用SPSS19.0软件对实验所得的数据进行统计处理。试验结果以±s表示，采用组间t检验进行处 理，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.5 细胞形态变化结果

实验过程中细胞形态变化见图1～4（以食管癌ECA-109细胞株为例）。

图1 加药之前食管癌ECA-109细胞株形态

图2 加入顺铂24 h后食管癌ECA-109细胞株形态

图3 加入石油醚100 μg/ml组24h后食管癌ECA-109细胞株形态

图4 加入乙酸乙酯50 μg/ml组24 h后食管癌ECA-109细胞株形态

2.6 肿瘤细胞的存活率结果

不同肿瘤细胞在北虫草不同极性部位的不同药物浓度下的存活率结果见表1。

表1 北虫草不同药物浓度对肿瘤细胞存活率的影响（/%，±s，n＝6）

表1 北虫草不同药物浓度对肿瘤细胞存活率的影响（/%，±s，n＝6）

注：*P＜0.05 vs空白对照组

组别 MCF-7细胞 ECA-109细胞 A549细胞石油醚部位1 μg/ml 97.81±0.0838 106.14±0.0708 99.12±0.0386石油醚部位10 μg/ml 100.33±0.0997 97.72±0.0671 98.24±0.0595石油醚部位50 μg/ml 76.45±0.1127 73.56±0.0930* 83.27±0.0822石油醚部位100 μg/ml 63.57±0.1015* 54.24±0.0392* 69.14±0.0574*乙酸乙酯部位1 μg/ml 95.62±0.0689 104.02±0.0744 102.93±0.0585乙酸乙酯部位10 μg/ml 92.97±0.0727 84.95±0.0669 97.47±0.0631乙酸乙酯部位50 μg/ml 72.69±0.0931* 72.77±0.0896* 82.10±0.0538乙酸乙酯部位100 μg/ml 86.60±0.0889 74.67±0.1246* 89.91±0.0983正丁醇部位1 μg/ml 100.58±0.0880 105.48±0.1088 103.71±0.0336正丁醇部位10 μg/ml 124.92±0.1162 99.62±0.1122 108.84±0.0441正丁醇部位50 μg/ml 96.96±0.1035 101.49±0.0818 98.42±0.0473正丁醇部位100 μg/ml 96.93±0.1052 87.59±0.0595 101.21±0.0573水提取部位1 μg/ml 88.74±0.0479 114.86±0.0961 76.58±0.0383*水提取部位10 μg/ml 88.02±0.0348 116.71±0.0933 89.24±0.0507水提取部位50 μg/ml 79.61±0.0609 113.92±0.1329 73.88±0.0365*水提取部位100 μg/ml 83.58±0.0434 107.62±0.1051 83.11±0.0863顺铂10 μg/ml 66.13±0.0757* 80.11±0.0984* 70.14±0.0462*

由表1可见，不同肿瘤细胞在北虫草不同极性部位的不同药物浓度下的存活率有所差别，表明北虫草不同极性部位的不同药物浓度对不同肿瘤细胞的抑制作用不同。就北虫草石油醚部位抑制食管癌ECA-109肿瘤细胞作用来说，除1 μg/ml浓度未显示对食管癌ECA-109肿瘤细胞的抑制作用外，其他浓度均有一定程度的抑制作用。乙酸乙酯部位50，100 μg/ml浓度和石油醚部位50，100 μg/ml浓度时，对食管癌ECA-109肿瘤细胞的抑制率较强；石油醚部位100 μg/ml浓度时，对乳腺癌MCF-7肿瘤细胞、肺癌A549肿瘤细胞的抑制率较强。

3 讨论

实验结果表明，北虫草石油醚部位和乙酸乙酯部位对受试细胞具有一定的抑制作用，其他不同极性部位对受试细胞作用不明显。

李万芳等[2]对山东北虫草石油醚提取部位进行GC-MS分析，北虫草石油醚提取部位中亚油酸相对含量高达63.28 %。另有研究表明[3]，二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）能激活Caspase-3和Bax表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达，从而诱导食管癌细胞凋亡，且与浓度呈正比，本实验证实了这一点。许多不饱和脂肪酸除了能杀伤肿瘤细胞外，还能参与体内的免疫调节[4]。袁宏莉等[5]研究表明，添加ω-3多不饱和脂肪酸（ω-3PUFA）患者的营养学指标和免疫功能指标水平高于对照组患者，表明不饱和脂肪酸有利于改善患者的免疫功能。提示可进一步研究北虫草中不饱和脂肪酸的具体成分，全面评估北虫草的抗肿瘤效果，充分挖掘其在疾病治疗方面的价值。

宛玉祥等[6]研究表明，雪峰虫草乙酸乙酯部位含有麦角甾醇（5.16 %）。据报道[7-9]，麦角甾醇对MCF-7乳腺癌细胞瘤系等4种癌细胞具有抗肿瘤活性。麦角甾醇抑制肿瘤细胞增殖机制可能与增高p21m RNA 和蛋白表达或通过抑制血管生长有关[10-11]。李洁等[12]研究发现，北虫草乙酸乙酯部位对小鼠的适应性免疫有促进作用，这个部位活性成分含有虫草素，虫草素的抗癌抑瘤效果已得到广泛验证。深入研究北虫草乙酸乙酯部位的具体成分，确定其具有抗肿瘤活性的化学物质，对于开发临床药品具有重要意义。

北虫草为药食两用真菌，本实验从药效学角度考察了不同极性部位的抗肿瘤活性，为研发北虫草临床药品提供了一定的实验依据。