补骨脂炮制方法优选的研究

陈李东 ，朱日然，张学顺，刘晓倩*

（1. 山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014；2. 老河口市疾病预防控制中心，湖北 襄阳 441800）

补骨脂，是豆科草本植物补骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果实，性温、味辛，归肾、脾经，有补肾固精、缩尿止带、温脾止泻、固冲安胎之功效[1]。临床广泛用于阳萎遗精、肾虚冷泻、腰膝冷痛、遗尿尿频、白癜风等。近年报道补骨脂还有抗氧化、抗菌、抗骨质疏松、抗肿瘤等作用[2]。

据《雷公炮炙论》记载，补骨脂“性本大燥，毒”[3]，其久服有毒副作用，入药前需经过炮制，降低其毒性。补骨脂炮制方法较多，主要有盐炙法、雷公法、清炒法、盐酒浸法、酒浸法、芝麻炒、蒸法等[4]。 其中《中国药典》（2015年版）记录的盐炙法为目前常用的炮制方法[5]，但相关研究表明，该法并不是补骨脂的最佳炮制方法[6]。鉴于此，本实验选用15种有代表性的炮制方法，分为3大类：含酒制法类、含盐制法类、其它制法类。采用高效液相色谱法（HPLC）测定各炮制品炮制前后有效成分（补骨脂素、异补骨脂素）和有毒性成分（补骨脂酚，具有肝肾毒性[7-8]）的变化，分析各炮制品中主要成分及其含量，进而选出最佳炮制方法，为临床应用提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

安捷伦1260分析型高效液相色谱仪；AB135-S型电子天平；超声波提取器（昆山市超声仪器公司）。

1.2 试药

补骨脂药材（批号：1804002，安国市任德兴药材有限公司）；异补骨脂素对照品（批号：R01A6F1，上海源叶公司）；补骨脂素对照品（批号：YJ07315A14，上海源叶公司）；补骨脂酚对照品（批号：YM0316SB13，上海源叶公司）；乙腈为色谱纯；甲醇为分析纯；绍兴黄酒（浙江塔牌公司）；水（娃哈哈纯净水）；黑芝麻和面粉（购于大润发超市）；食盐（山东盐业集团）；麸子（山东中医药大学附属医院）。

2 方法与结果

2.1 制备样品

2.1.1 含盐制法类

2.1.1.1 药典品 100 g补骨脂药材，加20 ml盐水（含盐2 g）闷润4 h，滤过，药材入炒锅，文火炒至膨胀，崩裂，放凉即得。

2.1.1.2 盐同炒品 50 g盐置于炒锅，炒至泛黄，加入100 g补骨脂药材，翻炒至药材崩裂或膨胀，除去盐，放凉即得。

2.1.1.3 盐水浸品 100 g补骨脂药材，加20 ml盐水（含盐2 g）浸泡24 h，晒干，药材入炒锅，文火炒至膨胀，崩裂，放凉即得。

2.1.1.4 盐水煮品 100 g补骨脂药材，加100 ml盐水（含盐2 g）浸泡24 h，滤过，药材置入装有1500 ml盐水（含盐2 g）的容器，武火加热煮沸，改文火煮1.5 h，晾干即得。

2.1.1.5 盐蒸炙品 100 g补骨脂药材，加100 ml盐水（含盐2 g）浸泡24 h，滤过，药材置入装有2000 ml盐水（含盐2 g）的蒸制容器，密闭蒸2 h，晾干即得。

2.1.2 含酒制法类

2.1.2.1 雷公制品 100 g补骨脂药材，加3倍量炮制用黄酒浸泡12 h，滤过，再加3倍量水浸泡72 h，滤过，蒸6 h，晾干即得。

2.1.2.2 酒浸炒品 100 g补骨脂药材，加3倍量炮制用黄酒浸泡24 h，滤过，药材入炒锅，文火炒至膨胀，崩裂，放凉即得。

2.1.2.3 酒焙品 100 g补骨脂药材，加50 ml炮制用黄酒闷润12 h，置于80 ℃烘箱，烘干，放凉即得。

2.1.2.4 盐酒浸炒品 100 g补骨脂药材，加3倍量炮制用黄酒（内溶2 g盐），拌匀，浸泡5 h，滤过，药材入炒锅，文火炒至膨胀，崩裂，放凉即得。

2.1.3 其他制法类

2.1.3.1 清炒品 100 g补骨脂药材入炒锅，文火炒至膨胀，崩裂，放凉即得。

2.1.3.2 芝麻焙品 100 g补骨脂药材，加3倍量炮制用黄酒（内溶2 g盐）浸泡24 h，过滤，加入100 g芝麻并与药材拌匀，置于80 ℃烘箱中烘干，去除黑芝麻，放凉即得。

2.1.3.3 芝麻炒品 100 g黑芝麻于炒锅内，翻炒至香气溢出，加入100 g补骨脂药材，继续翻炒至药材表面呈黑褐色或黑色，去除黑芝麻，放凉即得。

2.1.3.4 麸炒品 15 g麸皮于炒锅内，翻炒至起烟，加入100 g补骨脂药材，继续翻炒至药材表面呈黑色或黄褐色，去除麸皮，放凉即得。

2.1.3.5 面炒品 50 g面粉于炒锅内，翻炒至微黄色，加入100 g补骨脂药材，继续翻炒至药材表面呈白黑色或黄白色，去除面粉，放凉即得。

2.1.3.6 酒麸炒品 100 g补骨脂药材，加3倍量炮制用黄酒浸泡12 h，滤过，药材中加入麸皮并拌匀，置入炒锅中，翻炒至药材鼓起，表面呈焦黑色，去除麸皮，放凉即得。

2.2 方法学考察

2.2.1 色谱条件 Agilent C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；以乙腈（A）-水（B）为流动相， 梯度洗脱，程序为：0～8 min，20 %～40 % A；8～18 min，40 %～70 % A；18～21 min，70 %～85 % A；21～30 min，85 % A；30～32 min，20 % A；流速0.8 ml/min；进样量5 μl；柱温35 ℃；检测波长250 nm。

2.2.2 制备对照品溶液 分别精密称取3种对照品0.82，0.78，1.96 mg，甲醇溶解并定容于50 ml棕色量瓶，制得混合对照品溶液，补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚对照品浓度分别为16.4，15.6，39.2 μg/ml。

2.2.3 制备供试品溶液 分别取各炮制品和生品适量，粉碎后过60目筛，精密称取各粉末1.0 g，置入索氏提取器，加适量甲醇，加热回流法提取2 h，冷却后转移至250 ml量瓶，加甲醇定容，充分摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.2.4 线性关系考察 采用“2.2.1”项下色谱条件，精密吸取混合对照品溶液2，5，8，12，18，30 μl，注入高效液相色谱仪测定，测得峰面积，以进样量（X）为横坐标、峰面积值（Y）为纵坐标，分别建立3种对照样品的标准曲线，回归方程是：补骨脂素Y=6569.1X-3.8357（R²=0.9999），异补骨脂素Y=7712X-4.3324（R²=1），补骨脂酚Y=18884X+3.2053（R²=1）。通过标准曲线得出，补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚进样量范围分别为0.033～0.492 μg，0.031～0.468 μg，0.078～1.176 μg时呈良好线性关系。

2.2.5 精密度实验 采用“2.2.1”项下色谱条件，精密吸取混合对照品溶液5 μl，重复进样6次，记录混合对照品中补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚峰面积的RSD分别为0.80 %，0.75 %，0.31 %，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 采用“2.2.1”项下色谱条件，取“2.2.3”项下各供试品溶液5 μl，分别于0，2，4，6，12，24 h进样检测，记录各共有色谱峰峰面积的RSD均小于2.12 %，表明供试品在24 h内具有良好的稳定性。

2.2.7 重复性实验 采用“2.2.1”项下色谱条件，取“2.2.3”项下生品供试品溶液，连续进样测定5次，记录各共有色谱峰峰面积的RSD均小于1.93 %，表明此法具有良好的重复性。

2.2.8 加样回收率试验 精密称定含有量已知的药材粉末6份，每份约0.5 g，精密加入各对照品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得各成分加样回收率分别在99.34 %～102.17 %，RSD为0.66 %～0.83 %，表明此法稳定可行。

2.3 样品测定

采用“2.2.1”项下色谱条件，测定“2.2.3”项下各供试品溶液，记录各供试品的HPLC色谱图，见图1。

图1 各样品的色谱图

2.3.1 含盐制法类炮制品与生品HPLC色谱图比较结果 根据特征峰峰面积变化情况，对不同含盐制法类炮制品中补骨脂素和异补骨脂素升高幅度之和变化情况进行排名：盐蒸品>盐水浸品>药典品>盐同炒品，盐水煮品中二者含量降低。按照补骨脂酚下降幅度进行排名：盐水煮品>盐蒸品>盐同炒品>药典品>盐水浸品。结合中药炮制增效减毒的目的，选择盐蒸法作为含盐制法类的最佳炮制方法。结果见表1。

表1 盐制法类炮制品共有特征峰峰面积及变化情况/%

2.3.2 含酒制法类炮制品与生品HPLC色谱图比较结果 根据特征峰峰面积变化情况，对不同含酒制法类炮制品中补骨脂素和异补骨脂素升高幅度之和变化情况进行排名：酒焙品>雷公品>酒浸品>盐酒浸品；有效成分含量均提高。按照补骨脂酚下降幅度进行排名：酒焙品>雷公品>酒浸品>盐酒浸品。选择酒焙法作为含酒制法类的最佳炮制方法。结果见表2。

表2 酒制类炮制品共有特征峰峰面积及变化情况/%

2.3.3 生品与其他制法类炮制品HPLC色谱图谱比较结果 将生品与炮制品HPLC色谱图对比，观察特征峰峰面积变化情况，对其他制法类炮制品中补骨脂素和异补骨脂素升高幅度之和变化情况进行排名：芝麻烘品>面炒品>清炒品>芝麻炒品，麸炒品和酒麸炒品中二者含量降低。按照补骨脂酚下降幅度进行排名：芝麻烘品>麸炒品>芝麻炒品>酒麸炒品>面炒品>清炒品。选择芝麻烘法为其他制法类的最佳炮制方法。结果见表3。

表3 其他制法类炮制品共有特征峰峰面积及变化情况/%

2.4 指标性成分含量测定

选取盐蒸法、酒焙法、芝麻焙法供试品溶液测定指标性成分含量，平行试验3次，计算平均值，计算指标性成分的总含量Y值，总含量（Y）=有效成分含量值（A）+有效成分含量值（B）-毒性成分含量值（C）。结果测得酒焙品的Y值最高，确定为最佳炮制方法。结果见表4。

表4 指标性成分含量测定

3 讨论

补骨脂为传统中药，临床多以炮制品入药以降低其毒副作用，2015年版《中国药典》收载盐炙为其主要的炮制方法。近年，有关补骨脂临床不良反应报道越来越多[9-12]，补骨脂的用药安全问题亟待解决，其炮制方法成为安全用药的一个突破点。

本实验选取15种具有代表性的补骨脂炮制方法，分成3类进行炮制。对比生品和各炮制品的HPLC色谱图发现：（1）补骨脂炮制品未见已有成分的消失或新成分生成，炮制后化学成分只是含量的变化，而未发生质变；（2）其他制法类各炮制品的HPLC色谱图存在明显差异，未呈现出规律性，升降不一，推测不同辅料可能对补骨脂的化学成分含量变化影响较复杂；（3）含盐制法类各色谱峰的变化趋势基本一致。（4）含酒制法类中，各色谱峰的变化趋势基本一致；（5）各炮制品中补骨脂酚的含量均降低了，因补骨脂酚具有挥发性[13]，推测其在炒、蒸等加热的过程中挥发了[14]。因补骨脂酚具有肝、肾毒性[7-8]，其含有量下降说明炮制具有减毒的功效。

今后，本实验将进一步研究酒焙法的炮制工艺，优化酒制炮制工艺，考察补骨脂炮制前后的药效学变化，进一步为临床合理安全的应用补骨脂提供依据。