葛根素通过Fetuin B-AMPK/ACC 信号通路减轻2 型糖尿病小鼠肝脏胰岛素抵抗

高俊凤，刘曼曼，郭召平，胡春平，冯珍凤，严 军

1上海中医药大学研究生院，上海 201203；2上海中医药大学联合培养单位//上海市嘉定区中医医院内分泌科，上海 201899

2型糖尿病（T2DM）以糖脂代谢紊乱为主要表现，胰岛素抵抗是T2DM 发病的关键因素，肝脏在全身代谢调节中发挥着至关重要的作用，肝脏胰岛素抵抗导致的代谢紊乱是影响机体葡萄糖和脂质代谢的关键［1-2］。Fetuin B是近年来新发现的半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员之一，是一种新型的肝脏分泌蛋白，由肝脏产生分泌入血［3］。研究表明，Fetuin B增多会引起糖代谢和脂代谢异常，而且Fetuin B在体内长期积累会增加胰岛素抵抗的风险，但其在代谢中的具体作用机制尚不明确［4-5］。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）即丝氨酸/苏氨酸激酶AMP依赖的蛋白激酶，是一种重要的能量感应酶，是调节机体能量代谢的总开关。乙酰辅酶A羧化酶（ACC）是一种依赖生物素的变构羧化酶，是AMPK的下游分子，AMPK/ACC通路抑制可加重胰岛素抵抗，从而加剧葡萄糖和脂质代谢紊乱。最新的一项研究表明，Fetuin B抑制胰岛素信号传导，加重心肌缺血再灌注损伤，而大量研究表明，在啮齿动物中，心肌缺血再灌注损伤可通过激活AMPK/ACC通路改善心肌胰岛素抵抗，起到保护心脏的作用［6-10］。那么在肝脏中，Fetuin B是否会抑制AMPK/ACC通路加重胰岛素抵抗？

葛根具有调节免疫、降血糖、降血脂、抗氧化等药理作用，属于在临床上运用广泛且治疗效果颇佳的中药。葛根素可以通过激活AMPK相关通路改善胰岛素抵抗，调节糖脂代谢［11-13］。那么葛根素是否通过抑制AMPK/ACC信号通路上游Fetuin B激活此通路发挥作用？故本研究拟通过T2DM小鼠模型，探讨葛根素调控肝脏Fetuin B-AMPK/ACC信号通路改善胰岛素抵抗作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

4～5周龄SPF级健康雄性C57BL/6J小鼠50只，体质量13～17 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：北京百善SCXK（京）2016-0006。动物饲养场所是北京维通利华实验动物技术有限公司上海分公司，实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2017-0014。动物饲养在SPF级屏障环境中的实验动物设施IVC系统，动物房温度22±5 ℃，相对湿度（50±10）%，明暗周期12 h/12 h（光照时间8∶00～20∶00），鼠笼每日清洁消毒，所有小鼠自由饮水，自由饮食。本实验经上海中医药大学伦理会委员会批准。

1.2 试剂

高脂饲料[60%Kcal High-Fat（DIO）Diet，美 国RDI]；葛根素（Sigma)。链脲佐菌素（STZ,Sigma）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，上海源叶生物）；小鼠胰岛素ELISA试剂盒、小鼠甘油三酯（TG）ELISA 试剂盒、小鼠胆固醇（TC）ELISA 试剂盒、小鼠游离脂肪酸（FFA）ELISA 试剂盒（武汉华美生物）；RIPA 裂解液、ECL发光剂（上海碧云天）；BCA 试剂盒[生工生物工程（上海）]；AMPKα1、P-AMPKαT183/T172、ACC、P-ACCS79 Antibody（Abcam）、内参抗体GAPDH，英国abcam，生工生物工程（上海））；Fetuin B Antibody（成都正能生物）；HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit（南京诺唯赞生物）。

1.3 仪器

罗氏血糖仪及试纸[罗氏诊断产品（上海）有限公司]；高速恒温冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；微量移液器（日本NICHIRYO）；SLAN-96P 全自动医用PCR分析系统（上海宏石医疗）；酶标仪（Bio Tek）；GENE GNOME SYNGENE BIO IMAGING（Bio Tek）；显微镜XD-202（南京江南永新光学）。

1.4 方法

1.4.1 模型制备 4～5周龄小鼠适应性喂养1周后，随机选择40 只小鼠进行造模，10 只小鼠作为正常对照组（ND）。ND组给予基础饲料，造模组给予高脂饲料6周后，禁食12 h，腹腔注射STZ（100 mg/kg），注射后继续喂养高脂饲料4周，剪尾采血，以连续2 d空腹血糖≥13.9 mmol/L为糖尿病模型成功［14］。

1.4.2 分组与给药 按照标准，造模成功的小鼠共32只，采用随机数字表法将32 只小鼠分为高脂饲料喂养的模型对照组（HFD），葛根素低剂量组（Pue-50组，50 mg/kg），葛根素中剂量组（Pue-100组，100 mg/kg），葛根素高剂量组（Pue-200组，200 mg/kg），8只/组，高脂饲料喂养持续至实验终点。分组后开始1次/d定时给药，ND组和HFD组给予等体积的生理盐水灌胃，0.5%CMC-Na溶解葛根素，制备成葛根素混悬液［15-17］，灌胃给药，干预时间为8周。

1.4.3 小鼠一般情况监测 在实验过程中，每天观察并记录小鼠的毛色、饮食、饮水及二便情况、精神状态，直至给药结束。

1.4.4 取材 给药结束后，各组小鼠隔夜禁食8 h，10%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，眼球取血，室温静置30 min，以3000 r/min离心10 min，分离血清，保存在-20 ℃冰箱中以备后续实验检测。小鼠仰卧位固定于操作台上皮肤消毒后，打开腹腔，快速分离肝脏，用生理盐水洗涤，取部分于4%多聚甲醛固定，部分置于冻存管液氮速冻，最后腹腔注射过量10%戊巴比妥钠麻醉，10 min后检查小鼠生命体征，确保小鼠被处死。

1.4.5 指标检测

1.4.5.1 血糖检测 造模10周后连续2 d禁食8 h尾静脉取血检测空腹血糖（FBG），给药4周和8周分别以尾静脉剪尾取血检测FBG。

1.4.5.2 小鼠血清空腹胰岛素测定 以小鼠胰岛素ELISA试剂盒测定小鼠血清胰岛素浓度（FINS），根据公式计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）：HOMA-IR=（FBG×FINS）/22.5［18］。

1.4.5.3 小鼠肝脏TG、TC、FFA测定 取出肝组织，用无水乙醇制备成10%肝组织匀浆，离心，取上清。采用ELISA试剂盒测定小鼠肝脏匀浆上清液TG、TC、FFA的含量。

1.4.5.4 小鼠肝脏HE染色 经4%多聚甲醛固定肝脏组织梯度脱水，石蜡包埋，切片（5 μm横截面），HE染色，中性树胶封片，并在显微镜下观察肝脏的组织学变化，并进行图像采集。

1.4.5.5 小鼠肝脏Fetuin B免疫组化 取适量固定于4%多聚甲醛肝脏组织，石蜡包埋切片，用二甲苯脱腊，0.5 mol/L柠檬酸缓冲溶液抗原修复，3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶，滴加一抗（Fetuin B 1∶100），4 ℃下孵育过夜，37 ℃复温60 min，滴加二抗，37 ℃30 min，加DBA显色，显微镜下观察，采集图像。结果判定：细胞质或细胞核呈棕黄色颗粒者为Fetuin B阳性产物。在200倍视野范围随机选择5个视野，输入IPP6.0图像分析软件测定肝细胞中棕黄色颗粒的平均光密度值，值越大反映Fetuin B表达水平越高。

1.4.5.6 Q-RT-PCR 法检测小鼠肝脏Fetuin B-AMPK/ACC通路mRNA表达 取小鼠肝脏组织100 mg，加入液氮研磨后备用。使用Trizol试剂提取小鼠肝脏组织总RNA，按照HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书操作，去除基因组的DNA，将总RNA逆转录成单链cDNA，进行实时荧光定量PCR，配制PCR反应体系，每个基因做3个复孔和1个阴性对照，在PCR分析仪上进行DNA扩增，扩增反应条件为变性95 ℃30 s，退火58 ℃30 s，延伸72 ℃30 s 30个循环。以β-actin为内参基因，校正目标基因的荧光强度。所有引物由上海东寰生物科技有限公司设计合成（表1）。

表1 Q-RT-PCR引物序列Tab.1 Q-RT-PCR primer sequences

1.4.5.7 Western blot法检测小鼠肝脏Fetuin B-AMPK/ACC通路蛋白表达 取小鼠肝脏组织100 mg，液氮研磨后加入含有97%RIPA+1%PMSF+1%蛋白酶抑制剂+1%磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液及相关抑制剂中，匀浆液离心，4 ℃，12 000 r/min，3 min，取上清。按照BCA蛋白质浓度测定试剂盒完成蛋白定量；制备聚丙烯酰胺凝胶，并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），将蛋白转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，37 ℃下在封闭液中封闭PVDF膜1 h，洗膜，将膜放在一抗稀释液中（按说明书稀释），4 ℃冰箱孵育过夜。次日用TBST洗膜3次，15 min/次。将洗好的膜放入稀释好的二抗中（按说明书稀释），室温孵育1 h，用TBST洗膜3次，15 min/次。显影：ECL发光试剂盒显影，用GENE GNOME 系统曝光显像，导出图片，用ImageJ软件对条带进行灰度值分析，以GAPDH为内参蛋白，校正目的蛋白灰度值。

1.5 统计分析

采用SPSS24.0软件对数据进行处理，数据采用均数±标准差表示，满足正态性、方差齐性的计量资料采用独立样本t检验或单因素方差分析，多个样本均数间的多重比较用LSD检验；满足正态性，不满足方差齐性时，多个样本均数间的多重比较用Dunnett's T3检验。不满足正态性、方差齐性的计量资料用非参数的秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。所有实验都是独立重复3次。

2 结果

2.1 葛根素对T2DM小鼠FBG和胰岛素抵抗的影响

造模10周1 d、2 d HFD组与ND组相比，FBG升高（P<0.01）。不同剂量葛根素给药后，与HFD组相比，Pue-50 mg/kg给药组FBG有下降趋势，但差异无统计学意义；Pue-100 mg/kg和Pue-200 mg/kg给药组小鼠FBG均明显下降（P<0.01）。Pue-50 mg/kg、Pue-100 mg/kg 和Pue-200 mg/kg给药组较HFD组，FINS、HOMA-IR均显著降低（P<0.01，表2）。

表2 葛根素对小鼠FBG和胰岛素抵抗的影响Tab.2 Effects of puerarin on FBG and insulin resistance in T2DM mice(Mean±SD)

2.2 葛根素对T2DM小鼠肝脏TG、TC、FFA的影响

与ND组相比，HFD组小鼠肝脏TG、TC、FFA含量增多（P<0.01）。与HFD组相比，Pue-100 mg/kg和Pue-200 mg/kg 给药组小鼠肝脏TG、TC、FFA 含量均下降（P<0.01）。Pue-50 mg/kg给药组与HFD组相比有下降趋势，但差异无统计学意义（表3）。

表3 葛根素对T2DM小鼠肝脏TG、TC、FFA的影响Tab.3 Effects of puerarin on hepatic TG,TC and FFAin T2DM mice(Mean±SD)

2.3 葛根素对T2DM小鼠肝脏组织病理变化的影响

ND组小鼠肝组织结构完整，肝小叶结构正常，肝细胞排列整齐呈现肝索状，且大小均匀，核圆居中，胞浆内无空泡，肝细胞无脂肪变性；HFD组小鼠肝小叶内肝索结构紊乱，肝细胞形态异常，肝小叶边界模糊，胞浆内出现空泡，肝细胞肿胀伴有严重脂肪变性；Pue-50 mg/kg给药组小鼠肝脂肪变性较HFD组有一定程度的减轻，但肝细胞排列欠规整，肝索结构仍显紊乱，肝细胞内稍有水肿伴有轻度肝脂肪变性，胞浆内有少量脂肪样空泡；Pue-100 mg/kg和Pue-200 mg/kg给药组小鼠肝细胞呈索状排列，较为整齐，肝细胞无明显水肿，胞浆内可见少许的脂肪空泡，与HFD组相比，肝脂肪变性程度明显改善（图1）。

图1 葛根素对T2DM小鼠肝脏病理变化的影响Fig.1 Effects of puerarin on liver pathology in T2DM mice(HE staining,original magnification:×200).A:ND group;B:HFD group;C:Pue-50 mg/kg;D:Pue-100 mg/kg;E:Pue-200 mg/kg.

2.4 葛根素对T2DM小鼠肝脏Fetuin B免疫组化的影响

ND组小鼠肝细胞质内见少量棕黄色颗粒，肝细胞Fetuin B表达正常，未见明显病理变化；HFD组见大量棕黄色颗粒，肝细胞Fetuin B表达增加，免疫组化染色较ND组非常明显；Pue-50 mg/kg 和Pue-100 mg/kg给药组棕黄色颗粒较HFD组减少，Fetuin B表达有所降低，免疫组化染色较HFD组有所减轻；Pue-200 mg/kg给药组棕黄色颗粒较HFD组明显减少，Fetuin B表达明显降低，免疫组化染色较HFD组明显减轻（图2，表4）。

表4 葛根素对T2DM小鼠肝脏Fetuin B含量的影响Tab.4 Effect of puerarin on hepatic fetuin B content in T2DM mice(Mean±SD)

2.5 葛根素对T2DM小鼠肝脏Fetuin B-AMPK/ACC通路mRNA表达的影响

与ND组相比，HFD组Fetuin B、ACC mRNA表达升高，AMPKmRNA表达降低（P<0.01）。与HFD组相比，经过8周药物干预，给药组肝脏Fetuin B mRNA表达均有所降低（P<0.01）；Pue-100 mg/kg 和Pue-200 mg/kg给药组肝脏AMPK mRNA 表达升高（P<0.01）；Pue-100 mg/kg 和Pue-200 mg/kg 给药组肝脏ACC mRNA表达明显降低（P<0.01）；Pue-50 mg/kg给药组有上调AMPK mRNA表达，下调ACC mRNA表达的趋势，但差异无统计学意义（图3）。

2.6 葛根素对T2DM小鼠肝脏Fetuin B-AMPK/ACC通路蛋白表达的影响

与ND 组相比，HFD组Fetuin B、ACC蛋白表达升高（P<0.01），AMPKα1、P-AMPKα T183/T172、P-ACC S79蛋白表达均降低（P<0.01）。治疗后，与HFD组相比，葛根素呈剂量依赖性降低Fetuin B、ACC蛋白表达（P<0.01），呈剂量依赖性升高AMPKα1、P-AMPKαT1183/T172、P-ACC S79蛋白表达（P<0.01，图4）。

图4 葛根素对T2DM小鼠肝脏Fetuin B-AMPK/ACC通路蛋白表达的影响Fig.4 Effects of puerarin on the protein expression of fetuin B-AMPK/ACC pathway in the liver of T2DM mice.ND:Normal control group;HFD:Model control group;**P<0.01 vs ND;##P<0.01 vs HFD.

3 讨论

本研究证实葛根素下调肝脏Fetuin B水平，从而激活AMPK/ACC通路，促进AMPK磷酸化，抑制ACC活性，改善T2DM小鼠肝脏胰岛素抵抗。葛根素改善胰岛素抵抗的重要机制之一为上调AMPK，但相关分子机制尚不明确［19-20］。已有研究表明AMPK作为调节糖脂代谢的关键酶，参与葡萄糖、脂肪酸的合成和氧化分解，在正常生理状态下，AMP/ATP比率上升时，AMPK被激活，抑制消耗能量的生物合成途径（肝脏脂肪酸、胆固醇合成以及β细胞的胰岛素分泌），激活产生ATP的分解代谢途径（多种组织的脂肪酸摄取和氧化，糖酵解），调节细胞能量代谢平衡［21-22］。在高血糖、高血脂的病理环境下，AMPK下调导致正常生理调节机制发生紊乱，信号通路相关蛋白调控发生改变，反而激活下游靶点ACC的活性，抑制脂肪酸氧化，刺激脂质沉积，降低胰岛素敏感性，加剧胰岛素抵抗，进而加重T2DM的进展［23-25］。本研究T2DM小鼠中，葛根素在mRNA水平上调AMPK，提示AMPK mRNA转录增多、降解减少，相关调控可能发生在转录前，如激活上游某种相关调控因子?有研究发现高脂诱导肥胖小鼠模型和HepG2肝脂肪变性细胞模型中Fetuin B表达上调，AMPK下调，而沉默肥胖模型小鼠和HepG2细胞模型Fetuin B基因后，AMPK磷酸化增强，肝脏脂肪变性减轻［26］。提示Fetuin B可能是AMPK的上游负调控因子。而本研究中，T2DM小鼠模型给予葛根素干预后，肝脏Fetuin B、ACC在mRNA和蛋白水平均显著降低，AMPK则明显升高，证实了葛根素下调Fetuin B水平，激活AMPK/ACC信号通路。那么Fetuin B调控AMPK/ACC通路是否在胰岛素抵抗中发挥作用？

Fetuin B是一种影响糖脂代谢的重要新型肝脏细胞因子，基因位于鼠16号染色体，人3号染色体，而该位点是糖尿病等代谢疾病的遗传基因易感位点［27-30］。有研究发现高脂饮食诱导小鼠肝原代细胞胰岛素敏感性受损，是由脂肪变性改变肝细胞的蛋白分泌，Fetuin B分泌异常增多所致［31］。最新的一项研究中，T2DM小鼠敲除Fetuin B基因后，心脏Fetuin B水平降低，胰岛素受体底物1（IRS-1）、丝氨酸位点磷酸化增强，膜表面葡萄糖转运体-4（Glut4）数量增加，心肌组织胰岛素信号传导改善［6］。故认为Fetuin B是T2DM胰岛素抵抗中的关键因子。本实验中，T2DM小鼠较ND组肝脏Fetuin B含量增加，FBG、FINS、HOMA-IR均明显升高证实了以上推测。这亦与基于T2DM伴胰岛素抵抗人群的一项研究中Fetuin B水平显著升高的结果一致［32］。同时T2DM小鼠给予葛根素干预，随着浓度增加，肝脏TG、TC、FFA水平降低，肝脏HE染色提示肝脂肪变性明显减轻，血清FBG、FINS及HOMA-IR降低，胰岛素抵抗明显改善，糖脂代谢紊乱纠正。进一步行免疫组化及Western Blot检测肝脏Fetuin B表达均明显下降，Q-RT-PCR检测肝脏AMPK mRNA水平显著上调，ACC mRNA水平显著下降；Western Blot检测AMPK、P-AMPK、P-ACC均明显升高，ACC 明显下调，提示葛根素通过下调肝脏Fetuin B水平，激活AMPK/ACC信号通路，刺激AMPK活化，抑制ACC活性，加快脂肪酸氧化和糖酵解。既往研究报道了葛根素广泛的药理特性，减弱胰岛素抵抗是其中之一，而对其改善T2DM 胰岛素抵抗的分子机制报道较少［33］。本实验在此基础之上，进一步证实葛根素改善T2DM胰岛素抵抗的分子机制之一可能是通过肝脏Fetuin B-AMPK/ACC信号通路，丰富了葛根素在调控胰岛素抵抗中的作用。

综上所述，Fetuin B-AMPK/ACC通路与T2DM小鼠胰岛素抵抗相关，葛根素能够通过下调肝脏细胞因子Fetuin B干预AMPK/ACC通路的相关蛋白调控，增强AMPK磷酸化，增加P-ACC蛋白表达，降低ACC活性，从而改善胰岛素抵抗，调节糖脂代谢，延缓T2DM 进程。本实验初步阐明了葛根素介导Fetuin B-AMPK/ACC信号通路对T2DM胰岛素抵抗的调控机制，但由于时间限制，仅进行了表型研究，下一步研究将结合体外细胞转染、转基因小鼠等进一步验证。此外，Fetuin B是否可以调控其他糖脂代谢相关通路有待进一步探索。