MiR-4719通过靶向调控ARHGAP36抑制人乳腺癌细胞的迁移和侵袭

李 侨，邱宇翔，金 婷，柳满然，侯懿烜

重庆医科大学1临床检验诊断学教育部重点实验室，2基础医学实验教学中心，重庆 400016

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁女性健康［1］。侵袭转移是恶性肿瘤重要的生物学特征，与乳腺肿瘤复发以及乳腺癌患者预后不良密切相关，同时也是导致患者死亡的主要原因［2］，然而驱动乳腺肿瘤发生转移的分子机制尚不清楚［3］。因此，深入研究乳腺癌的转移机制，可以为开发新的乳腺癌诊治策略提供理论基础，有利于改善患者的生存率和预后。

微小RNA（miRNA）是一类由18～25个核苷酸组成的小分子非编码RNA，在多种细胞和生理过程中发挥重要作用，与多种人类肿瘤的进展和转移有关［4-5］。miRNA调控乳腺肿瘤转移的作用机制不一而足，包括调节上皮间充质转化［6］、肿瘤干细胞特性［7］、肿瘤微环境［8］、血管形成［9］以及外泌体［10］等。例如：miR-140-5p通过靶向调控VEGF-A抑制乳腺癌细胞的血管形成和侵袭［11］；miR-204-5p可通过重塑肿瘤免疫微环境减弱乳腺癌的增殖和迁移［12］，提示乳腺肿瘤中某些miRNA异常，不仅影响乳腺癌发生发展，并可能是乳腺肿瘤转移评估和生物治疗的有效生物标志物和靶点［13］。然而，诸多miRNA在乳腺癌中的作用及相关的分子机制尚待研究。本研究通过TCGA数据库中miRNA测序数据，挖掘出miR-4719在乳腺癌组织中表达下调，但该miRNA在乳腺癌中的生物学作用尚未见报道。作为表观遗传学的一个重要组分，miRNA主要通过干扰靶mRNA翻译或促进其降解下调蛋白质或长链非编码RNA的表达来发挥调节作用［14］。因此，我们进一步借助microT在线网站对miR-4719的潜在靶基因进行生物信息学预测，分析发现ARHGAP36是其最可能的潜在靶基因。Rho GTP酶活化蛋白36（ARHGAP36）属于Rho GTP酶蛋白家族成员。该蛋白家族参与了细胞的黏附与迁徙、细胞骨架重组、肿瘤血管生成、上皮间质转化等多项生理过程，在肿瘤的发展与转移中起重要作用［15］。对该家族蛋白成员的研究显示，ARHGAP4可调控哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路和低氧诱导因子1α信号通路，进而促进胰腺癌的生长［16］；ARHGAP9在乳腺癌中高表达，且可促进乳腺癌的侵袭迁移［17］。此外，ARHGAP36已被报道在甲状腺癌、髓母细胞瘤以及嗜铬细胞瘤中高表达，与这些肿瘤的恶性进展相关［18］。基于这些研究背景，我们推测miR-4719可能通过靶向ARHGAP36在乳腺肿瘤侵袭转移中发挥重要作用。

在本研究中，我们较深入地研究了miR-4719 对ARHGAP36的调控作用，以及miR-4719/ARHGAP36信号轴对乳腺癌细胞侵袭转移的影响。本研究不仅丰富了我们对乳腺癌转移机制的认识，同时为临床乳腺癌的侵袭转移潜能的评估和预后监测提供了有潜在价值的生物标志物。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

RPMI 1640、DMEM 细胞培养液，胎牛血清及0.25%胰酶（Gibco）；Lipofectamine 2000 转染试剂及TRIzol提取试剂（Invitrogen）；PrimeScriptTMRT Reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaLa）；miR-4719、U6、ARHGAP36及β-actin基因引物（上海生物工程）；RIPA裂解液、PMSF 和BCA蛋白浓度检测试剂盒（碧云天）；抗ARHGAP36多克隆抗体（Invitrogen）；抗β-Actin单克隆抗体（SAB）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG（中杉金桥）；电化学发光液（Bio-Rad）；miR-4719 mimics 及NC mimics、sh ARHGAP36 及 对 照shRNA（shNC）和荧光素酶报告基因载体（吉玛制药）；ARHGAP36过表达质粒及其空载体质粒（金开瑞）。

实验仪器：CO2恒温细胞培养箱和4 ℃低温离心机（Thermo），双垂直板电泳槽，DYY III稳压稳流电泳仪（六一生物科技），数字凝胶成像系统（Bio-Rad），荧光定量PCR仪（Thermo），超微量分光光度计（Thermo）。

1.2 组织标本

30 例未经放化疗的乳腺癌病人肿瘤组织及癌旁正常组织取自于重庆医科大学附属第一医院进行手术治疗的乳腺癌患者，标本被保存于重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室。患者签署了知情同意书，乳腺癌标本的收集均完全符合重庆医科大学伦理委员会（审批号：2020-762）的规定。

1.3 细胞及其培养

人乳腺癌MDA-MB-231，BT549细胞，人正常乳腺上皮细胞MCF-10A和人胚胎肾细胞HEK293T由重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室提供。MDA-MB-231 和HEK293T 细 胞 用 含10% FBS 的DMEM 培养基培 养，BT549 细 胞 用含10% FBS 的RPMI 1640培养基培养，MCF-10A细胞用含5%马血清、20 ng/mL表皮生长因子、10 μg/mL胰岛素、100 ng/mL霍乱病毒和0.5 μg/mL氢化可的松的DMEM/F12培养液培养。所有细胞均置于37 ℃、含5%CO2的无菌恒温培养箱中培养，2～3 d更换新鲜培养基。待细胞生长至融合度为80%～90%时，进行传代。细胞处于对数生长期时进行实验。

1.4 细胞转染

待乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT549生长至融合度为50～60%时，将miR-4719 mimics和NC mimics、sh ARHGAP36 和shNC、ARHGAP36 过表达质粒和Vector按说明书陈述的步骤分别转染BT549和MDAMB-231细胞。转染24 h后收集细胞，TRIzol法提取总RNA。

1.5 组织RNA的提取

无菌剪刀剪碎50 mg组织，加入1 mL TRIzol 试剂于冰上研磨匀浆，组织充分溶解后收集悬浮液。加入200 μL 三氯甲烷，使用涡旋器震荡混匀，静置20 min 后离心；取透明层与等体积异丙醇（400 μL）混匀，室温静置离心，加入适量75%冰酒精清洗沉淀，晾干后加入适量DEPC水溶解RNA沉淀。

1.6 逆转录和实时定量PCR（qRT-PCR）

用PrimeScriptTMRT Reagent Kit 试剂盒按说明书陈述的步骤将RNA逆转录为cDNA，置于-40 ℃冰箱中稳定保存。使用Nanodrop-2000超微量分光光度计进行RNA浓度/纯度检测。用配套的实时荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex TaqTM，ddH2O，引物以及cDNA配制PCR反应体系，然后使用实时荧光定量分析仪进行PCR扩增。

miRNA的PCR反应条件：95 ℃，2 min；95 ℃，10 s；57 ℃，20 s；72 ℃20 s。循环40次。

mRNA的PCR反应条件：95 ℃，30 s；95 ℃，30 s；53 ℃，30 s；72 ℃，20 s。循环40次。以β-actin为内参基因，结果以2-ΔΔCt值表示目的RNA的相对表达水平。

1.7 蛋白质印迹法

收集细胞，加入RIPA裂解液（含1%PMSF），冰上裂解细胞30 min。低温离心机中转速12 800×g 离心30 min，吸取上清液，弃沉淀。向2 μL上清与18 μL PBS混合液中加入200 μL BCA，37 ℃水浴箱中孵育30 min，用分光光度仪检测吸光度值A562nm，根据吸光度值计算出总蛋白浓度。将各组蛋白浓度调整一致后，加入1/4蛋白液总体积的上样缓冲液，沸水浴中加热5 min，置于-80 ℃冰箱中保存。每孔加样40 μg 蛋白，进行SDSPAGE电泳。电泳完成后在恒流的条件下将分离的蛋白条带转移至0.22 μm聚偏氟乙烯膜（PVDF）。待转膜完成后，用10%脱脂奶粉将PVDF膜室温封闭2～4 h，在4 ℃冰箱孵育一抗过夜。PVDF膜在TBST中用摇床振摇洗涤3次，每次10 min。室温下，再将膜用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG二抗孵育80 min，TBST摇洗3次。电化学发光显色液覆盖膜，用凝胶成像分析仪（Bio-Rad）对蛋白条带进行显影。

1.8 细胞划痕实验

收集并计数各组细胞，按5×105/孔的细胞密度在六孔板中进行铺板，每组设置3个复孔。将各组细胞置于37 ℃，5%CO2的无菌恒温细胞培养箱中培养，待细胞贴壁后，用200 μL枪头垂直均匀划线，用PBS洗涤漂浮的细胞3次，分别于0 h和24 h时用光学显微镜在40倍的放大倍数下拍照。应用图像分析软件ImageJ对细胞迁移率进行计算。细胞迁移率=(初始划痕面积－相应点划痕面积)/初始划痕面积×100%。

1.9 Transwell实验

在Transwell小室的滤膜上预先加入40 μL稀释好的基质胶（无血清培养基与基质胶的体积比为1∶8）。消化离心收集各组细胞，用无血清培养基重悬细胞后混匀计数。向24孔板的每个孔中加入500 μL含10%FBS的培养基，Transwell小室中加入200 μL含3.0×104细胞的无血清的细胞悬液，每组设置3个复孔，置于37 ℃，含5%CO2的孵箱中培养13 h后取出小室，PBS缓冲液清洗、4%多聚甲醛固定细胞15 min，再用湿棉签擦拭去掉小室内的细胞，晾干，0.5%结晶紫染色5 min，于PBS中清洗后晾干。正置相差光学显微镜下，对左、右、上、下、中5个视野（100×）拍照，计算5个视野的平均值代表每孔细胞的侵袭能力。

1.10 双荧光素酶报告实验

构建ARHGAP36 3'-UTR 野生型（ARHGAP36-WT）和突变型（ARHGAP36-MUT）荧光素酶表达载体。按照lipofectamine2000说明书，将ARHGAP36-WT和ARHGAP36-MUT质粒分别与miR-4719 mimics和NC mimics一起转染HEK293T细胞。48 h后弃去培养液，用细胞裂解液冰上裂解细胞30 min，低温离心机中12 800×g离心10 min，吸取上清液，向上清中加入荧光素酶底物反应，3 min 后用双荧光素酶检测系统（Promega）测定荧光素酶活性。

1.11 免疫组化染色

将用乳腺癌病人组织制成的石蜡切片预先在80 ℃烤箱中烘烤2 h，脱蜡复水（依次将载玻片放入二甲苯10 min，3次；无水酒精5 min，2次；95%酒精，5 min，70%酒精5 min，50%酒精5 min），3%H2O2溶液封闭过氧化物酶10 min，然后将切片置于柠檬酸钠缓冲液中微波炉加热10 min进行抗原修复。血清封闭15 min后，与抗ARHGAP36一抗（1∶100）在4 ℃孵育过夜。HRP标记的聚合物偶联二抗染色切片1 h。将免疫复合物用DAB显色5～8 min，细胞核用苏木素复染30 s，脱水，透明，中性树胶封片。待封片干燥后在显微镜下观察拍照。

1.12 统计学方法

实验结果数据的统计学分析采用SPSS 22.0 软件。组内两两比较采用独立样本t检验，以均数±标准差表示计量资料。组间关联性分析使用卡方检验。P<0.05代表差异有统计学意义。本研究所有实验均独立重复3次。

2 结果

2.1 miR-4719在乳腺癌患者组织中表达下调并且与不良预后相关

qRT-PCR结果显示，miR-4719在乳腺癌组织中表达量显著下调（P<0.001，图1A）。此外，通过KM plotter数据库分析发现，miR-4719低表达与乳腺癌患者的不良预后明显有关（P=0.007，图1B）。

2.2 miR-4719可抑制乳腺癌细胞BT549和MDA-MB-231的迁移和侵袭

qRT-PC结果显示：MDA-MB-231和BT549中miR-4719的水平相对正常乳腺细胞MCF-10A显著下调（P<0.01，图2A）；miR-4719 mimics组中miR-4719的表达水平相对NC mimics组细胞明显升高（P<0.01，图2B）。细胞划痕实验和Transwell 实验结果证明，过表达miR-4719显著抑制了细胞的迁移能力（P<0.05，图2C、D）和侵袭能力（P<0.05，图2E、F）。

图2 miR-4719在乳腺癌细胞中表达下调并且可抑制细胞的迁移和侵袭Fig.2 miR-4719 is downregulated in breast cancer cells and miR-4719 mimics inhibits cell migration and invasion.A:miR-4719 was downregulated in breast cancer cells compared to normal breast cell MCF-10A.**P<0.01 vs MCF-10A.B:Overexpressing efficiency of miR-4719 was detected by qRT-PCR.**P<0.01 vs NC mimics.C,D:Cell migration capacities were detected by wound healing assay (Scale bar=100 μm).*P<0.05 vs NC mimics.E,F:Cell invasion abilities determined by Transwell assay(Scale bar=100 μm).*P<0.05 vs NC mimics.

2.3 miR-4719靶向抑制ARHGAP36的表达

利用miRNA靶基因在线预测网站microT（http://diana.cslab.ece.ntua.gr/ microT/），我们发现ARHGAP36是miR-4719最有可能的靶基因（图3A）。qRT-PCR结果显示：与癌旁正常组织相比，ARHGAP36在乳腺癌组织中表达量显著上调（P<0.001，图3B）。相关性分析则发现ARHGAP36和miR-4719存在明显的负相关关系（r=-0.5345，P<0.01，图3C），这与人乳腺癌组织免疫组化染色的结果一致（P<0.001，图3D）。此外，qRT-PCR 结果表明：相较于MCF-10A 细胞，ARHGAP36在乳腺癌细胞中的表达水平亦显著增加（P<0.01，图3E、F）；过表达miR-4719 可以明显降低ARHGAP36的表达水平（P<0.01，图3G）。双荧光素酶报告实验的结果进一步证实：过表达miR-4719可显著减弱ARHGAP36-WT 的荧光素酶活性，而对ARHGAP36-MUT的荧光素酶活性无影响（图3H）。综上所述，miR-4719可通过直接结合在ARHGAP36的3'-UTR抑制ARHGAP36的表达。

图3 ARHGAP36是miR-4719的靶基因Fig.3 ARHGAP36 is the target gene of miR-4719.A:Potential target genes of miR-4719 were predicted by online website microT.B:The expression of ARHGAP36 was detected by qRT-PCR in breast cancer tissues (n=30).***P<0.001.C:Pearson correlation analysis of miR-4719 and ARHGAP36 expression in breast cancer tissues(n=30).D:ARHGAP36 protein level was determined using IHC staining in breast cancer tissues (×100,scale bar=100 μm).***P<0.001.E,F:mRNA and protein level of ARHGAP36 in breast cancer cells were detected by qRT-PCR and Western blotting,respectively.**P<0.01,***P<0.001 vs MCF-10A.G:ARHGAP36 RNA level was detected by qRT-PCR after the transfection with miR-4719 mimics.**P<0.01 vs NC mimics.H:The binding of miR-4719 to ARHGAP36 was verified by dual-luciferase reporter assay.**P<0.01 vs NC mimics.

2.4 敲低ARHGAP36可抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭

qRT-PCR 和western blot 结果证明，转染小发夹RNA后癌细胞中ARHGAP36的表达被有效沉默（P<0.01，图4A、B）。细胞划痕实验和Transwell实验结果显示，沉默ARHGAP36可有效抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力（P<0.05，图4C～F）。

图4 敲低ARHGAP36抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭Fig.4 Knockdown of ARHGAP36 inhibits the migration and invasion of breast cancer cells.A,B:Knockdown efficiency of ARHGAP36 measured by qRT-PCR and Western blotting.C,D:Cell migration capacities detected by wound healing assay(Scale bar=100 μm).E,F:Cell invasion abilities determined by Transwell assay.*P<0.05,**P<0.01 vs shNC group.

2.5 过表达ARHGAP36可逆转外源性miR-4719对乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力的抑制

qRT-PCR和western blot结果证实，在过表达miR-4719的乳腺癌细胞中外源导入ARHGAP36质粒可有效恢复ARHGAP36在RNA和蛋白水平的表达（P<0.01，图5A、B）。进一步的功能实验表明，恢复ARHGAP36的表达能有效逆转过表达miR-4719导致的MDA-MB-231 和BT549 细胞迁移和侵袭能力的下降（P<0.05，图5C～F）。

图5 过表达ARHGAP36可以促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭Fig.5 Overexpression of ARHGAP36 promotes the migration and invasion of breast cancer cells.A,B:RNA and protein level of ARHGAP36 were detected by qRT-PCR and western blot,respectively.C,D:Cell migration capacities detected by wound healing assay (Scale bar=100 μm).E,F:Cell invasion abilities determined by Transwell assay (Scale bar=100 μm).*P<0.05,**P<0.01.

3 讨论

乳腺癌转移的分子机制极其复杂。大量研究表明，遗传多样性、表观修饰和肿瘤微环境等因素均与乳腺癌的转移密切相关［19-22］。例如，Chen等［23］发现，ZMYND8可被p300/CBP蛋白乙酰化，乙酰化的ZMYND8可进一步激活HIF通路，从而促进乳腺癌的转移。然而，我们对引起乳腺肿瘤转移的生物学过程仍知之甚少［24］，因此更全面详尽地阐明驱动肿瘤转移的作用机制值得进一步深入探讨。

miRNA作为遗传多样性的重要范畴之一，可参与调控细胞的增殖、分化和侵袭等多种生物学过程，在肿瘤转移的各个阶段均发挥重要作用。如：miR-454-3p、miR-615-3p、miR-200c和miR-141等已被报道在不同阶段参与乳腺癌的转移［25-27］；miR-34a可通过靶向调控c-met 的表达抑制肝癌细胞的迁移和侵袭［28］。然而，miRNA作用的组织以及条件特异性严重阻碍了有关miRNA的研究被有效转化到临床肿瘤的诊治中［29］。因此，深入探究miRNA在乳腺癌转移中的作用及其分子机制对临床干预乳腺癌转移具有重要价值。本研究发现：miR-4719在乳腺癌细胞和癌组织中显著下调，与患者的预后不良明显相关；此外，miR-4719可显著抑制细胞的迁移和侵袭。这些结果提示miR-4719可能通过靶向调控某些基因的表达在乳腺癌的转移中起抑制作用。

据报道，ARHGAP36在甲状腺癌、髓母细胞瘤以及嗜铬细胞瘤中均表达升高，且其异常表达可促进肿瘤细胞的锚定非依赖性生长、增殖和迁移［30-31］。其中，锚定非依赖性生长是肿瘤转移的重要因素之一，提示ARHGAP36 可能与肿瘤的转移紧密相关。然而，ARHGAP36 在乳腺癌转移中的生物学作用尚未见报道。我们的研究结果显示，ARHGAP36在乳腺癌组织和细胞中表达升高，并且乳腺癌组织中miR-4719与ARHGAP36的表达呈明显的负相关关系。双荧光素酶报告实验结果也进一步证实miR-4719可以与ARHGAP36的3'-UTR直接结合，说明ARHGAP36是miR-4719的一个靶基因。功能实验则进一步证实敲除ARHGAP36明显减弱了乳腺癌细胞的迁移和侵袭，而过表达ARHGAP36则可逆转过表达miR-4719对细胞迁移和侵袭能力的抑制，表明miR-4719通过干扰ARHGAP36的表达在乳腺癌的转移中起到抑制作用，因此我们的结果可能为乳腺癌的早期诊断提供新的肿瘤生物标志物。

综上所述，本研究发现一种新的miRNA即miR-4719，并证实其在乳腺癌组织中低表达，且与预后不良相关。分子机制上，miR-4719通过靶向调控ARHGAP36对乳腺癌细胞的迁移和侵袭发挥作用。此外，我们还首次证明了ARHGAP36在乳腺癌中发挥了促癌细胞的迁移和侵袭作用。然而，miR-4719/ARHGAP36信号轴具体是如何调控乳腺细胞的侵袭迁移，miR-4719在乳腺癌患者血清或血浆中的表达能否用于乳腺癌转移潜能和预后预测，这些问题将值得进一步研究。