Xpert MTB/RIF Ultra检测脑脊液对结核性脑膜炎的诊断价值

黄麦玲 孙晴 王桂荣 李文胜 杜亚东 蔡宝云 黄海荣 李琦 初乃惠

结核性脑膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染而导致的脑膜非化脓性、亚急性或慢性感染性疾病，发病率虽仅占结核病的1%～5%[1]，但死亡率及中枢神经系统后遗症的发生率却高达50%[2]。脑脊液(cerebral spinal fluid，CSF)中找到MTB是TBM诊断的“金标准”，但传统病原学诊断方法常导致诊断延误，不利于患者预后。而核酸扩增技术因较传统方法可明显提高病原学检测敏感度，且耗时短，在近些年发展迅速，尤以超敏结核分枝杆菌和利福平耐药基因(Xpert MTB/RIF Ultra，简称“Xpert Ultra”)检测技术表现突出。

目前，对Xpert Ultra检测CSF诊断TBM的研究还较少[3-8]，且多存在研究样本量偏小、研究对象多为TBM并发HIV感染者、研究结果不一致等问题。又由于CSF菌阴(涂片及培养)TBM患者中MTB的荷菌量较培阳TBM患者更少，导致目前还没有评估Xpert Ultra对CSF菌阴TBM患者诊断价值的相关研究。另外，Xpert Ultra主要通过增加多拷贝序列IS6110/IS1081来提高其检测敏感度，然而，由于流行的MTB菌株因国家或地区而异，其IS6110/IS1081的数量也差别较大[9-10]，故有必要评估不同地区TBM患者应用Xpert Ultra检测的诊断价值。为此，笔者通过扩大样本量来评估Xpert Ultra检测CSF对我国HIV阴性TBM的诊断价值，为 Xpert Ultra的临床应用提供依据。

对象和方法

一、研究对象

1.一般情况：连续纳入2017年1月至2018年12月首都医科大学附属北京胸科医院就诊的189例疑似TBM患者，依据入组及诊断标准最终纳入151例患者。其中，TBM患者(TBM组)106例，包括32例确诊、55例很可能、19例可能；非TBM患者(非TBM组)45例，包括18例病毒性脑膜炎、12例细菌性脑膜炎、7例隐球菌性脑膜炎、3例恶性肿瘤、3例癫痫和2例脑血管疾病。所有患者HIV检测和CSF抗酸染色涂片镜检均为阴性；TBM患者中有30例因CSF标本少而未行CSF中 MTB的BACTEC MGIT 960液体培养(以下简称“MGIT 960培养”)，60例(56.6%)患者在采集CSF前进行了1～120 d的抗结核药物治疗。两组患者基本人口学及临床特征见表1。

表1 不同人口学特征及临床特征在结核性脑膜炎组和非结核性脑膜炎组分布情况

2.诊断标准：按照国际统一的TBM诊断标准[11]分为确诊、很可能和可能TBM。(1)确诊：具备脑膜炎症状或体征，同时具备CSF抗酸染色涂片镜检、培养、核酸扩增检测均阳性，或脑组织病理表现与结核病病理表现一致且同时抗酸染色阳性等MTB病原学任一阳性者；(2)很可能：有头颅CT或MRI检查，且TBM临床评分≥12分；无头颅CT或MRI检查者，TBM临床评分≥10分；同时除外其他疾病，但CSF或头颅影像学评分至少2分；(3)可能TBM：有头颅CT或MRI检查者，TBM临床评分6～11分；无头颅CT或MRI检查患者，TBM临床评分6～9分；同时除外其他疾病。如果头颅CT和MRI检查、腰椎穿刺均未做，则不能诊断或除外TBM。非TBM指需要与TBM进行鉴别诊断的疾病。

3.入组标准：所有因病情需要行腰椎穿刺检查，且无腰椎穿刺禁忌证并同意入组的疑似TBM患者。有以下情况之一者均需排除：未明确诊断、并发HIV感染、无中枢神经系统疾病症状、CSF标本量不足、GeneXpert MTB/RIF(简称“Xpert”)和Xpert Ultra检测结果不确定。本研究通过首都医科大学附属北京胸科医院伦理审查委员会批准[编号：(2018)年临审第(21)号]，且所有患者均签署知情同意书。

二、研究方法

1.主要仪器及试剂：BACTEC MGIT 960液体培养系统及培养基分枝杆菌生长指示管(美国Becton Dickinson公司)；-80 ℃超低温冰箱(美国Thermo公司)。Xpert检测仪、Xpert和Xpert Ultra 检测试剂盒(美国赛沛公司)；中性罗氏培养基(珠海市银科医学工程有限公司)；7H9培养基粉和利福平药粉(美国Sigma公司)。

2.CSF留取：留取患者腰椎穿刺后常规检查剩余的CSF标本至少3 ml，其中，1 ml CSF标本冻存于-80 ℃拟行Xpert Ultra检查，其余CSF直接行Xpert、抗酸染色涂片镜检和培养。

3.实验方法：抗酸染色涂片镜检、培养及表型药物敏感性试验(简称“表型药敏试验”)参照《结核病诊断实验室检验规程》[12]进行标准化操作。Xpert和Xpert Ultra的检测步骤严格按照检测试剂盒说明操作，报无效结果者使用相同样本重复进行Xpert Ultra或Xpert检测。

4.结果的判读：根据循环阈值(Ct)和所检测探针的阳性情况对Xpert Ultra检测MTB菌量的半定量进行估计，分为“高”“中”“低”“极低”或“痕量”。Ct值介于15～18.9表示“高”，19～24.9表示“中”，25～28.9表示“低”，29～40表示“极低”，而“痕量”表示IS6110/IS1081阳性但rpoB阴性的少菌标本。

三、统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行数据的统计分析，偏态分布的计量资料以“中位数(四分位数)[M(Q1，Q3)]”表示，两组间差异的比较采用Manne-WhitneyU检验。计数资料采用“百分率或构成比(%)”表示，两组间差异的比较采用χ2检验(当总样本数≥40，理论频数≥5时)或Fisher精确概率法(当总样本数<40，理论频数<5时)；两组配对资料的比较采用McNemar卡方检验，均以P<0.05为差异有统计学意义。以临床诊断为参考标准，采用敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、一致率、Kappa值评估Xpert Ultra、Xpert、MGIT 960培养对TBM的诊断效能，其中，敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%，特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%，阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%，阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%，一致率=(真阳性例数+真阴性例数)/总患者例数×100%；Kappa值≥0.75，说明两种方法诊断结果一致性较好；0.4≤Kappa值<0.75，说明两种方法诊断结果一致性一般；Kappa值<0.4，说明两种方法诊断结果一致性较差。采用维恩图展示Xpert Ultra、Xpert、MGIT 960培养检测CSF阳性的患者例数。

结 果

一、 Xpert Ultra检测CSF中MTB的负荷情况

Xpert Ultra对45例非TBM患者的检测结果均为阴性；而对106例TBM患者的检测阳性结果为47例，包括14例(29.8%)MTB负荷半定量估计为“低”者，13例(27.6%)为 “极低”者，20例(42.6%)为“痕量”者，无“高”和“中”结果。同时，Xpert对106例TBM患者的检测阳性结果为26例，其中14例为培养阳性者。

二、 Xpert Ultra检测CSF对TBM的诊断价值

以临床诊断为参考标准，Xpert Ultra检测106例 TBM患者的敏感度和特异度分别为44.3%(47/106)和100.0%(45/45)，而Xpert为24.5%(26/106)和100.0%(45/45)，二者敏感度差异有统计学意义(χ2=16.000，P<0.01)。Xpert Ultra检测76例行CSF培养的TBM患者的敏感度为44.7%(34/76)，而MGIT 960培养的敏感度仅为18.4%(14/76)，二者敏感度差异有统计学意义(χ2=12.893，P<0.01)。具体见表2。

表2 Xpert Ultra、Xpert和MGIT 960培养以临床诊断为参考标准检测脑脊液对TBM的诊断效能

三、 Xpert Ultra检测CSF对很可能和可能TBM的诊断价值

Xpert Ultra、Xpert和MGIT 960培养检测CSF的阳性者分别为47、26、14例，其中，Xpert Ultra、Xpert和MGIT 960培养检测CSF单一阳性者分别为21、2、4例(图1)。当结合Xpert Ultra检测结果重新诊断TBM时，55例很可能和19例可能的TBM患者中分别有17例(30.9%)和4例(21.1%)被纳入，则对TBM的确诊率从30.2%(32/106)提高至50.0%(53/106)。

四、 Xpert Ultra检测CSF不同培养结果TBM患者的诊断价值

在行CSF标本MGIT 960培养的76例TBM患者中，Xpert Ultra对62例(81.6%)培养阴性患者检测的阳性率[38.7%(24/62)]明显高于Xpert[21.0%(13/62)]，差异有统计学意义(χ2=7.692，P=0.003)；而对14例培养阳性患者检测的阳性率[71.4%(10/14)]与Xpert[57.1%(8/14)]的差异无统计学意义(χ2=0.500，P=0.500)，且Xpert Ultra和Xpert对培养阳性患者的检测敏感度[分别为71.4%(10/14)和 57.1%(8/14)]均高于其对培养阴性TBM患者的检测敏感度[分别为 38.7%(24/62)和21.0%(13/62)]，差异均有统计学意义(χ2=4.925，P=0.026；Fisher精确概率检验，P=0.017)。

五、 抗结核治疗对Xpert Ultra检测CSF的影响

Xpert和Xpert Ultra对接受抗结核治疗TBM患者CSF的阳性检出率[分别为13.3%(8/60)和20.0% (12/60)]均明显低于未接受抗结核治疗患者[分别为39.1%(18/46)和76.1%(35/46)]，差异均有统计学意义(χ2=9.360，P=0.002；χ2=33.189，P<0.01)。且两种方法对接受抗结核治疗的TBM患者的阳性检出率差异无统计学意义(χ2=1.125，P=0.289)，但Xpert Ultra对未接受抗结核治疗的TBM患者的阳性检出率明显高于Xpert(χ2=15.059，P<0.01)。

六、 Xpert Ultra检测CSF对利福平耐药检测结果的分析

14例经CSF培养阳性且完成表型药敏试验的TBM患者中，经Xpert和Xpert Ultra同时检出rpoB基因突变者1例，未检出rpoB基因突变者5例，与表型药敏试验结果一致；另外8例患者中，3例仅Xpert检出无rpoB基因突变，其中1例Xpert Ultra检测利福平耐药结果不确定，2例Xpert Ultra检测阴性；2例仅Xpert Ultra检出无rpoB基因突变，其中1例Xpert检测利福平耐药结果不确定，1例Xpert检测阴性；1例Xpert Ultra检出存在rpoB基因突变但Xpert检测为阴性；2例Xpert及Xpert Ultra检测结果均为阴性。另外，62例 CSF培养阴性的TBM患者中，Xpert Ultra和Xpert分别检出14例和12例发生rpoB突变，其中两种方法均检出rpoB基因突变者1例。

讨 论

TBM是预后最差的结核病，及时诊治能明显改善患者预后，但目前尚缺乏较理想的诊断方法。Xpert检测系统因其具有全封闭、全自动化操作、污染可能性小、人为错误少、结果精确度高、检测周期短、敏感度高等优势[13-14]，已成为具有里程碑意义的结核病诊断新方法。但Xpert对菌量较少标本的检测敏感度较低[15]，而新一代Xpert Ultra在原有Xpert反应体系及设备上进行了改进，使检测MTB的低限从Xpert的112.6 CFU/ml下降至15.6 CFU/ml[10]，并缩短检测周期至84 min，检测少菌标本(如肺外结核、MTB/HIV双重感染、儿童结核病等)的敏感度也较Xpert明显增高[16]。因此，WHO于2017年3月推荐新一代Xpert Ultra检测方法可以替代Xpert用于结核病诊断[17]。

本研究显示，在106例临床诊断为TBM(包括确诊、很可能、可能TBM)的患者中， Xpert Ultra检测CSF诊断TBM的敏感度(44.3%)明显高于Xpert(24.5%)和MGIT 960培养(18.4%)，差异均有统计学意义，与Wang等[3]对43例HIV阴性TBM患者的研究结果一致。2018年，Bahr等[4]首次应用Xpert Ultra、Xpert和MGIT 960快速培养对23例HIV阳性的TBM患者进行离心后CSF检测，在确诊和很可能的TBM患者中，Xpert Ultra检测的敏感度(69.6%)高于Xpert(43.5%)。2020年，Cresswell等[5]采用前瞻性队列研究的方法进行了51例TBM患者的研究，发现Xpert Ultra检测CSF的敏感度(76.5%)高于Xpert(55.6%)和MGIT 960培养(61.4%)，结果与上述研究一致。但本研究中，Xpert Ultra、Xpert和MGIT 960培养检测CSF的敏感度均低于文献[4]研究结果，可能与以下原因有关：其一，研究发现Xpert Ultra检测CSF培养阳性患者的阳性率高于培养阴性患者，提示Xpert Ultra检测CSF的阳性率与其荷菌量相关。其二，基于有研究认为HIV阳性的TBM患者CSF中的MTB荷菌量高于HIV阴性的TBM患者[18]，本研究未纳入HIV阳性TBM患者，而文献[4]纳入了HIV阳性的TBM患者。其三，本研究以确诊、很可能、可能的TBM患者作为研究对象，而文献[4]仅以确诊和很可能TBM患者作为研究对象，使得本研究对荷菌量更低的“可能TBM患者”的检出能力降低，且有可能是非TBM。其四，越来越多的证据表明，较大量的CSF可以增加Xpert及Xpert Ultra诊断TBM的敏感度[7, 19]。本研究采用未离心的1 ml CSF进行检测，而文献[4]采用较大量(≥3 ml)的CSF行离心后检查，增加了细菌负荷，进一步提高了检测敏感度。最后，Thwaites等[20]研究发现，抗结核治疗6～15 d行核酸检测的敏感度(28%)明显低于抗结核治疗前(38%)，Donovan等[7]也在随访Xpert Ultra、Xpert基线研究中发现，治疗3～4周后的TBM患者检测阳性率明显下降，与本研究结论一致。

2020年，Donovan等[7]使用Xpert Ultra检测CSF对TBM的诊断价值进行了一项前瞻性多中心随机对照研究，发现在HIV阴性TBM(包括确诊、很可能、可能TBM)患者中，Xpert Ultra 检测的敏感度(38.9%)与Xpert(22.9%)差异无统计学意义(P=0.23)。但本研究两者敏感度的差异有统计学意义(P<0.01)。可能与该研究样本量是按照Xpert Ultra检测敏感度应至少高于Xpert的25%设计的，当Xpert Ultra检测敏感度不足25%时，则不能得出差异有统计学意义的结论[7]；而本研究的样本量多于Donovan等的研究，且为同一样本配对研究，更利于得到有效结果。

对62例CSF培养阴性的TBM患者而言，Xpert Ultra检测CSF的阳性检出率(38.7%)明显高于Xpert(21.0%)，提示Xpert Ultra对CSF涂阴培阴TBM患者的诊断优势更为明显。本研究纳入的所有TBM患者的CSF涂片检查均为阴性，且有81.6%(62例)的患者CSF的培养结果也为阴性，Xpert Ultra检测CSF可使其中38.7%的患者获得确诊，较Xpert的确诊率提高了17.7%，对避免神经系统后遗症的发生和改善患者预后有重要意义。

本研究还显示，Xpert Ultra、Xpert和MGIT 960培养对HIV阴性TBM患者CSF的检测特异度、阳性预测值均为100.0%，与其他研究一致[3-7]，也提示Xpert Ultra检测CSF的阳性患者不会出现误诊。然而，本研究Xpert和Xpert Ultra的检测敏感度分别为24.5%和44.3%，阴性预测值分别为36.0%和43.3%，提示当两种方法检测结果为阴性时均不能除外TBM，仍需研发更有诊断价值的生物标志物以协助诊断TBM。

据报道，如果没有快速诊断和二线抗结核治疗方案的合理应用，利福平耐药TBM的死亡率将接近100%[21]。本研究中，Xpert Ultra检出2例利福平耐药TBM患者，其中1例与表型药敏试验结果一致。由于Xpert技术的广泛推广，全球130个国家在2010—2016年间应用Xpert技术对2300多万例患者进行了检测，使全球耐多药结核病的检出数量增加了3～8倍[22]。而Xpert Ultra运用了高分辨率熔解曲线技术，能更好地区分rpoB突变种类，可将“沉默突变”报告为“敏感”，且可灵敏地在混合感染中检测出利福平耐药情况，较Xpert技术进一步改进。然而，本研究应用Xpert Ultra检测利福平的耐药结果并未体现出其优于Xpert，这可能与研究样本量太少有关。

本研究Xpert Ultra检测阳性的47例TBM患者中，20例(42.6%)患者MTB负荷定量为“痕量”，这一结果主要通过新增添的IS6110和IS1081序列而获得，但IS6110的拷贝数在不同谱系的分枝杆菌中存在较大差异[9]，是不同地区Xpert Ultra诊断TBM敏感度存在差异的原因之一，也是本次研究的意义之一。如L1谱系含有的IS6110数量较少，而L2、L3和L4谱系的分离株中则含有20多个IS6110拷贝[9]，其中L2谱系中的现代北京基因IS6110最丰富[23]；Chen等[24]报道，中国73.9%的肺结核属于现代家系2，24.8%属于家系4，0.92%属于家系3，0.33%属于家系1；而来自乌干达和越南的患者，则分别以家系4和家系2为主[5，7]。虽然“痕量”结果不能获得rpoB基因耐药突变情况，但这一结果足以指导临床医生及时开始抗结核药物治疗。

本研究有60例(56.6%)TBM患者在采集CSF前进行了抗结核药物治疗，导致本研究主要结论(Xpert Ultra检测CSF诊断TBM的敏感度明显高于Xpert和MGIT 960培养)可能受到这部分患者的影响，不能更客观、全面地分析抗结核药物治疗前Xpert Ultra检测CSF对TBM的诊断价值。但本研究也对采集CSF前未接受抗结核治疗的患者进行了分层分析，发现Xpert Ultra对未接受抗结核治疗的TBM患者检测的敏感度明显高于Xpert。

总之，Xpert Ultra检测CSF诊断HIV阴性TBM的敏感度明显高于Xpert和MGIT 960培养，尤其对MTB培养阴性的TBM患者的阳性检出率明显优于Xpert，是目前诊断TBM最佳的病原学检测方法，值得临床推广应用。但其结果会受到抗结核药物治疗的影响，建议疑似TBM患者尽量在抗结核药物治疗前进行CSF的Xpert Ultra检测。