响应面法优化西兰花种子酶解生成萝卜硫素的条件

2021-07-07陈明媚李俊杰李晓丹肖军霞郭丽萍

青岛农业大学学报（自然科学版） 2021年2期

陈明媚，李俊杰，李晓丹,2，肖军霞,2，郭丽萍,2

(1. 青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛 266109; 2. 青岛特种食品研究院，山东青岛 266109)

流行病学研究表明，经常食用十字花科蔬菜(如西兰花、结球甘蓝、羽衣甘蓝、抱子甘蓝、花椰菜、白菜)可以降低肺癌、胃癌、乳腺癌、直肠癌、膀胱癌、前列腺癌和胰腺癌等癌症的发生[1-5]。这是由于十字花科蔬菜中含有的硫代葡萄糖苷(硫苷，glucosinolates)，在黑芥子酶(myrosinase)水解作用下生成的一系列具有生物活性的水解产物——异硫氰酸酯。萝卜硫素(又称莱菔子素，化学名称为1-异硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷，sulforaphane)是4-甲基亚磺酰基丁基硫苷(glucoraphanin)在黑芥子酶的作用下形成的一种异硫氰酸酯，相对分子质量为177.3，分子式为C6H11S2NO，结构式如图1[6]所示，是迄今为止发现的最为有效的植物源性抗癌物质之一，因而备受关注[7-8]。

图1 萝卜硫素分子结构式

西兰花(Brassicaoleraceavar.italica)，又称青花菜，绿花菜，是十字花科芸薹属一年生植物，与花椰菜和结球甘蓝同为甘蓝的变种。西兰花富含萝卜硫素，尤其是种子及其芽苗中，因此西兰花种子和芽苗是提取萝卜硫素的良好来源。西兰花种子中萝卜硫素的形成及提取条件虽然有相关报道[9-11]，但是都没有进行系统的研究及其条件优化。本文研究了酶解温度、时间、pH、Vc添加量、料液比对西兰花种子中萝卜硫素形成的影响，用响应面优化了最佳酶解条件，并通过气质联用技术(Gas chromatography-mass spectrometry, GC/MS)对种子中的异硫氰酸酯种类进行了分析。

1 材料与方法

1.1 材料

西兰花种子：‘翠绿75天’‘翠绿80天’‘碧玉’‘狼眼’‘惠绿早生’‘曼陀绿’购自南京理想种苗有限公司；‘绿玉80天’‘文兴’购自南京金盛达种子有限公司；萝卜硫素标准品：Sigma公司；乙腈(色谱纯)：中国医药集团上海化学试剂公司；二氯甲烷、抗坏血酸、柠檬酸、磷酸二氢钠等均为分析纯：南京化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-2802型紫外可见分光光度计：尤尼柯(上海)仪器有限公司；液相色谱仪Agilent 1200：安捷伦公司；FA/JA电子天平：上海精密科学仪器有限公司；HH-6型数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；GL-20G-H型离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：XDB-C18色谱柱(4.6×150 mm)；检测波长：254 nm；流速：0.6 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；洗脱程序：0 min～25 min～30 min，10%乙腈～60%乙腈～100%乙腈。

定量方法: 以一系列浓度的萝卜硫素标样溶液做标准曲线, 得Y= 519.81X，R2= 0.999 9, 在1.0～ 40.0 μg/mL 范围内都与峰面积呈良好的线性关系。

1.3.2 不同品种种子中萝卜硫素含量的测定

称取0.2 g种子，研磨成粉末，加入8 mL蒸馏水，37 ℃水解3 h后，用二氯甲烷萃取，旋转蒸发后，用10%的乙腈溶解，HPLC分析定量。

1.3.3 单因素试验

称取‘绿玉80天’西兰花种子 0.2 g，利用种子中的内源黑芥子酶进行酶解，在其他条件相同的情况下，分别采用不用的温度、时间、pH值、Vc添加量、料液比(种子质量∶蒸馏水体积)考察对萝卜硫素的提取效果。单因素试验设计如下：

水解温度：20 ℃，25 ℃，30 ℃，35 ℃，40 ℃，45 ℃，50 ℃，55 ℃，60 ℃；

水解时间：2 h，4 h， 6 h，8 h，10 h，12 h；

Vc添加量：0.02 mg/g， 0.06 mg/g， 0.10 mg/g，0.20 mg/g，0.40 mg/g，0.80 mg/g；

pH值：3，4，5，6，7，8；

料液比：1∶30 g/mL，1∶35 g/mL，1∶40 g/mL，1∶45 g/mL，1∶50 g/mL。

1.3.4 响应面法优化设计试验

表1 响应面分析因素水平编码表

1.3.5 GC/MS检测条件

色谱柱：Hp-5ms石英毛细管柱；载气：He；流速：1.0 mL/min；进样口温度：250 ℃；程序升温条件：50 ℃保持2 min，然后以10 ℃/min升温至250 ℃保持8 min。EI离子源温度：240 ℃；EI能量：70 eV；接口温度：250 ℃；四级杆温度：150 ℃；扫描范围：50～240 amu。

2 结果与分析

2.1 不同西兰花品种种子中的萝卜硫素含量

从图2可以看出，不同西兰花品种的种子中萝卜硫素含量差异很大，含量最高的为‘绿玉80天’，达5.35 mg/g；‘狼眼’和‘惠绿早生’次之，分别为1.74 mg/g和1.37 mg/g；相比之下，其他品种的种子中萝卜硫素的含量较低，‘翠绿80天’‘绿翠75天’和‘曼陀绿’种子中萝卜硫素含量不足1 mg/g。因此，西兰花种子中萝卜硫素的含量与品种有极大关系[12-13]。在后续试验中，选择‘绿玉80天’进行。

图2 不同西兰花种子中萝卜硫素含量

2.2 单因素试验

2.2.1 水解温度对萝卜硫素含量的影响

由图3可以看出，萝卜硫素的含量随温度的增高先增加后减少，当水解温度为40 ℃时，萝卜硫素含量最高，这与有的研究结果并不完全一致。原因可能是与品种有关，因为不同品种植物黑芥子酶的最适温度和pH是有较大差异的[14]，本研究中的萝卜硫素含量较高，其前体物质4-甲基亚磺酰基丁基硫苷的含量也可能较高，以及不同品种间黑芥子酶活性的差异也可能较大。硫代葡萄糖苷在黑芥子酶的作用下，会生成异硫氰酸酯、硫氰酸酯、腈类化合物、恶唑烷酮等一系列水解产物，水解同时受黑芥子酶和表皮特异硫蛋白(Epithiospecifier protein, ESP蛋白)的调控，当ESP蛋白活性强时，会导致腈类产生而降低异硫氰酸酯的含量[15]。研究表明，当加热温度达到60 ℃时，ESP蛋白的活性会受到抑制，而黑芥子酶的活性较高，会产生更多的萝卜硫素[16]。本研究中水解时间较长，黑芥子酶在相对较低的温度下长时间加热，其活性也可能会降低，因此导致温度升高到45 ℃后萝卜硫素的产量下降。

图3 温度对萝卜硫素含量的影响

2.2.2 水解时间对萝卜硫素含量的影响

由图4可以看出，随着酶解时间的延长，萝卜硫素含量先增加后减少，当酶解时间为6 h时，萝卜硫素含量达到最高。在一定温度下水解，可能随着加热时间的延长，黑芥子酶的活性会有所降低，也可能已经形成的萝卜硫素在水溶液中不稳定，发生降解反应导致其含量变少。综合考虑，水解时间控制在4～6 h为佳。

图4 时间对萝卜硫素含量的影响

2.2.3 Vc添加量对萝卜硫素含量的影响

Vc被认为是黑芥子酶的激活剂，有助于萝卜硫素的形成[15]。从图5可以看出，添加Vc后萝卜硫素含量有所增加，但是当超过0.1 mg/g后，反而会降低。Shen等[17]研究表明，添加一定的抗坏血酸后，西兰花种子酶解产生萝卜硫素的产量较未添加者增加，但添加量过大时反而会抑制萝卜硫素的生成。本文的研究也得到了相似的结果，可能Vc添加过量之后会抑制黑芥子酶的活性从而导致萝卜硫素形成减少。根据试验结果，Vc的添加量控制在0.02～0.1 mg/g较好。

图5 Vc添加量对萝卜硫素含量的影响

2.2.4 pH值对萝卜硫素含量的影响

从图6中可以看出，当pH值为5、6、7时，萝卜硫素含量较多，但在pH值5、6、7之间无显著差异(p>0.05)，但是当pH值继续降低时，萝卜硫素生成会减少，当pH为3时，萝卜硫素含量比pH为5时少58.5%，这是因为当pH<5时，会导致腈类物质的产生，从而使异硫氰酸酯的含量减少[18]。调整pH值后水解与直接用蒸馏水水解结果无显著性差异(p>0.05)，一般蒸馏水pH值在5.5～7，经检测，本试验所用蒸馏水pH值为5.52。因此，无须调整pH值进行水解。有研究表明，黑芥子酶在pH值5～7保持稳定[19]，pH值无论过高或过低，黑芥子酶活降低，而降低萝卜硫素含量。

图6 pH值对萝卜硫素含量的影响

2.2.5 料液比对萝卜硫素含量的影响

由图7可以看出，当料液比为1∶35～1∶45时，萝卜硫素含量较多，随着蒸馏水体积的增加，萝卜硫素含量反而降低，这可能是因为先酶解再用二氯甲烷萃取萝卜硫素，酶解用水体积不断增加，而萃取溶剂不变，反而导致萃取效率的下降，因而导致萝卜硫素含量降低。

图7 料液比值对萝卜硫素含量的影响

2.3 响应面法优化酶解生成萝卜硫素的条件

响应面设计及结果如表2所示。利用Design Expert软件对试验结果进行二次多元回归拟合，得到二次多项回归模型：Y=6.248-0.185X1+0.34X2+0.025X3-0.015 X1X2-0.035 X1X3-0.010 X2X3-0.41 X12-0.17 X22-0.12 X32

表2 响应面试验结果

回归分析中决定系数R2为0.971 5，表明方程的拟合度和可信度均很高，此模型可用于酶解萝卜硫素的条件分析和预测。

方差分析结果如表3所示。结果表明，模型的p<0.000 1，即对建立的水解条件的回归模型极显著，失拟项不显著，说明二次模型相关性良好。

由表3和图8a显示，温度的一次项(p<0.005)和二次项(p<0.000 1)显著影响萝卜硫素的含量，时间的一次项(p<0.000 1)和二次项(p<0.05)显著影响萝卜硫素的含量，但温度和时间的交互作用不显著(p=0.749 1)。在一定的水解时间下，随着水解温度的增加萝卜硫素的含量先增加后减少；在一定的温度下，随着水解时间的延长，萝卜硫素的含量也增加。

表3 回归模型方差分析

图8b显示Vc添加量的一次项和二次项对于萝卜硫素含量影响不显著，与温度的交互作用也不显著。图8c显示在一定的Vc添加量下，随着时间的增加，萝卜硫素的含量增加。但是时间和Vc添加量两者交互作用不显著。

图8 因素交互作用响应面图

2.4 工艺条件优化及验证试验

响应面优化结果，运用试验模型得到酶解生成萝卜硫素的最佳条件为：水解温度39.06 ℃、水解时间5.8 h、Vc添加量0.07 mg/g，为便于操作将温度设为39 ℃。为考察模型的可靠性和准确性，进行单因素最佳试验条件和随机组合进行验证性试验，结果如表4所示。在响应面优化的试验条件下，萝卜硫素的含量为6.41 mg/g，明显高于单因素最佳条件和随机组合，故本研究优化的水解生成萝卜硫素的条件具有实用价值。

表4 验证性试验结果

2.5 酶解产物的GC-MS检测结果

经GC-MS分析，通过在线计算机谱库检索，在‘绿玉80’西兰花种子水解产物中共检测出9种异硫氰酸酯及其腈类物质，其谱库检索相关性都很高。结果如表5所示。可以看出，萝卜硫素占总异硫氰酸酯及腈类的74.42%，为主要的酶解产物，其次是1-丁烯基异硫氰酸酯，占12.17%，萝卜硫腈仅为0.22%，表明ESP蛋白的活性很低。因此，绿玉是很好的萝卜硫素的来源。通过对8个品种进行发芽试验，绿玉的发芽率非常低，约20%；文兴的发芽率也较低，为60%左右；其他种子发芽率都很高，大于90%。因此，绿玉只适合萝卜硫素的提取，并不适合种植。