基于指纹图谱和化学计量法评价不同产地番石榴叶的质量

李 丹，冯靖雯，陈鸿平，刘友平，胡 媛

成都中医药大学西南特色中药资源国家重点实验室 中药标准化教育部重点实验室，成都 611137

番石榴叶为桃金娘科植物番石榴(PsidiumguajavaLinn.)的干燥叶，主要分布于广东、广西、四川、云南、福建及台湾[1]等地，具有燥湿健脾，清热解毒、涩肠止泻、消炎止血之功效[2-8]。现代研究表明，番石榴叶的主要有效成分包括黄酮类(番石榴苷、异槲皮苷、金丝桃苷、瑞诺苷、萹蓄苷、槲皮素)、三萜类，具有降血糖、抗氧化、抑菌等作用[9-12]。

目前，番石榴叶未被收录在2020版《中国药典》，但被《广西中药材标准》(1990年版)[4]、《广东省中药材标准第一册》(2004年版)[3]、《湖南省中药材标准》(2009年版)[6]、湖南省中药饮片炮制规范(2010版)[8]、《广西壮药质量标准》(第二卷 2011年版)[5]、《福建省中药饮片炮制规范》(2012版)[2]、《四川省中药饮片炮制规范》(2015年版)[7]收载，是地方标准收载药材。上述标准仅对番石榴叶中槲皮素进行了定性的薄层鉴定。关于番石榴叶药材质量方面的研究分析方法主要以大类成分含量及多成分定量为主[13-15]，难以全面反映药材质量。同时，番石榴作为重要的经济果木，资源丰富，但产地不一，亦难以控制番石榴叶的质量。综上，番石榴叶的质量标准和质量评价研究尚不完善，并亟待解决。

中药指纹图谱是一种评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性的综合、可量化的鉴定手段，现多用于评价中药材质量[16-19]。课题组前期建立了番石榴叶黄酮类成分一测多评法[20]，为番石榴叶质量控制提供了一定的基础。本研究以番石榴叶为研究对象，收集了31批不同产地的番石榴叶样品进行指纹图谱研究，采用相似度评价、聚类分析、主成分分析和正交偏最小二乘法-判别分析研究番石榴叶质量与产地的相关性，为番石榴叶的质量评价及质量标准研究提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪；Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm；Agilent 公司)；BN3000型万分之一电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；CP2000型十万分子一电子天平(德国Sartorius公司)；UPTUO-I-1000TE优普系列超纯水机(成都纯水科技有限公司)；SG8200HDT型超声波清洗器(上海冠特超声仪器有限公司)。

1.2 材料

鞣花酸(批号：CHB190126、成都克洛玛生物科技有限公司)；金丝桃苷(批号：CHB190107、成都克洛玛生物科技有限公司)；异槲皮苷(批号：CHB180628，成都克洛玛生物科技有限公司)；瑞诺苷(批号：CHB200621，成都克洛玛生物科技有限公司)、番石榴苷(批号：CHB190126，成都克洛玛生物科技有限公司)；萹蓄苷(批号：CHB180802，成都克洛玛生物科技有限公司)；乙腈(色谱纯，美国TEDIA有限公司)；甲醇；无水乙醇( 分析纯，成都市科龙化工试剂厂)。

1.3 药材

收集不同产地番石榴叶31批，经成都中医药大学严铸云教授鉴定为桃金娘科番石榴属植物番石榴(PsidiumguajavaLinn．)的叶。详细信息见表1。

表1 不同产地番石榴叶样品信息

续表1(Continued Tab.1)

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)；梯度洗脱(0～2 min，5% A；2～15 min，5%→13.5% A；15～40 min，13.5% A；40～65 min，13.5%→21.3% A；65～70 min，21.3%→5% A)；进样量：10 μL；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：254 nm。

2.2 对照品溶液制备

分别精密称定鞣花酸、金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、番石榴苷、萹蓄苷对照品适量，加甲醇制成含19.35 μg/mL鞣花酸、82.40 μg/mL金丝桃苷、82.40 μg/mL异槲皮苷、37.60 μg/mL瑞诺苷、75.12 μg/mL番石榴苷、81.52 μg/mL萹蓄苷混合对照品，即得。

2.3 供试品溶液的制备

精密称定各产地番石榴叶粉末约1.0 g(过四号筛),置于锥形瓶中，加入60%乙醇25 mL,超声30 min，滤过，用0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验

取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别平行测定6次，测得各共有峰相对保留时间的RSD均≤0.155%，相对峰面积均≤0.255%，表明仪器精密度良好(见表2、3)。

表2 混合对照品共有峰的相对保留时间

表3 混合对照品共有峰的相对峰面积

续表3(Continued Tab.3)

2.4.2 重复性试验

取样品S24适量，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，测得各共有峰相对保留时间的RSD均≤0.952%，相对峰面积均≤4.732%(见表4、5)。

表4 番石榴叶药材样品S24 HPLC图谱共有峰相对保留时间(重复性)

表5 番石榴叶药材样品S24HPLC图谱共有峰相对峰面积(重复性)

续表5(Continued Tab.5)

2.4.3 稳定性试验

取样品S24适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样，按“2.1”项下色谱条件，测得各共有峰相对保留时间的RSD均≤1.867%，相对峰面积均≤4.918%(见表6、7)。

表6 番石榴叶药材样品S24 HPLC图谱共有峰相对保留时间(稳定性)

表7 番石榴叶药材样品S24HPLC图谱共有峰相对峰面积(稳定性)

续表7(Continued Tab.7)

2.5 指纹图谱相似度分析

取不同产地的31批番石榴叶进行指纹图谱检测，将结果导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)，选择平均数为对照图谱生成方法进行指纹图谱相似度分析，在分析检验下，以R对照图谱作为参照图谱进行相似度计算(见表8)。31批番石榴叶药材中与R对照指纹图谱的相似度为0.720～0.928，其中大于0.9有10批，大于0.8有21批。相似度结果表明不同产地番石榴叶指纹图谱存在差异。31批番石榴叶色谱峰图见图1。不同产地番石榴叶的对照指纹图谱可检出14个共有峰，通过对照品(见图2)指认，确定9号峰为鞣花酸，10号峰为金丝桃苷，11号峰为异槲皮苷，12号峰为瑞诺苷，13号峰为番石榴苷，14号峰为萹蓄苷。以峰面积较大、峰形较好且保留时间居中的9号峰作为参照峰，计算其他各共有峰和参照峰的峰面积比值即相对峰面积(见表9)。

表8 番石榴叶指纹图谱相似度评价结果

续表8(Continued Tab.8)

表9 31批番石榴叶指纹图谱中共有特征峰的相对峰面积

图1 31批番石榴叶HPLC指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprint of 31 batches of Psidii Guajavae Folium注：9-鞣花酸；10-金丝桃苷；11-异槲皮苷；12-瑞诺苷；13-番石榴苷；14-萹蓄苷(下同)。Note:9-Ellagic acid;10-Hyperoside;11-Isoquercitroside;12-Reynoutrin;13-Guaijaverin;14-Avicularin (the same below).

图2 混合对照品的HPLC图Fig.2 HPLC chart of mixed reference substance

通过相似度对比发现相似度小于0.8的番石榴叶样品主要产自广西、广东，相似度大于0.9的番石榴叶样品主要产自四川、云南，说明不同产地番石榴叶样品差异大。通过对比两类的主要色谱峰峰面积发现产自广东、广西番石榴叶样品中9号峰鞣花酸、10号峰金丝桃苷、11号峰异槲皮苷、12号峰瑞诺苷、13号峰番石榴苷、14号峰萹蓄苷的平均峰面积均小于产自四川、云南的番石榴叶样品。

2.6 化学模式识别分析

2.6.1 聚类分析

为全面分析不同产地番石榴叶样品质量的影响，以14个共有峰峰面积作为变量，运用SPSS20.0软件对31批番石榴叶样品进行系统聚类分析，采用组间联接聚类法，度量标准为Pearson相关性，结果见图3。31个样品被分为三大类，3个分类中，四川米易、德昌，云南丽江聚为一类；广西玉林、南宁、崇左、百色，广东信宜、广州、汕头，海南海口聚为一类；上述2类番石榴叶的地理位置分别相近，各自聚为一类，说明不同产地的番石榴叶药材可以通过聚类分析对番石榴叶样品进行分类质量品质评价。

图3 番石榴叶的系统聚类分析Fig.3 System cluster analysis of Psidii Guajavae Folium

2.6.2 主成分分析及正交偏最小二乘法判别分析

主成分分析法(principal component analysis)是一种通过降维技术把多个变量化为少数几个主成分(综合变量)的统计分析方法。这些主成分能够反映原始变量的绝大部分信息，它们通常表示为原始变量的某种线性组合。正交偏最小二乘判别分析(orthogonal PLS-DA，OPLS-DA)是一种有监督的判别分析统计方法，其最大的特点是可以除自变量X中与分类变量Y无关的数据变异，使分类信息主要集中在一个主成分，使模型更简单和易于解释，其判别效果及主成分得分图的可视化效果更加明显。

以14个共有峰峰面积为变量，采用SIMCA(14.1)软件对31批番石榴叶样品进行PCA，结果提取到2个具有最大特征制得主成分(PC)，总贡献率为55.1%，其中PC1贡献率为37.2%，贡献率最大；PC2贡献率为17.9%。由前2个主要成分建立坐标系，得到31批番石榴叶的PCA得分图 (图4)，由图4可见，大部分样品均在95%可信区间，且能分为两类。其中大部分广东、广西、福建、海南番石榴叶样品聚为一类，四川、云南聚为一类，与聚类分析结果一致。据中国地理分布图及行政区划发现四川、云南位于以大兴安岭、太行山脉、巫山及雪峰山的界限的第二阶梯(平均海拔1 000～2 000 m)，属于西南地区；广西、广东、福建海南位于以大兴安岭、太行山脉、巫山及雪峰山为界限的第三阶梯(平均海拔500 m以下)，属于沿海地区。综上，2个主要成分能反映不同产地番石榴叶的主要特征，提示沿海地区和西南地区的番石榴叶在化学成分含量上存在差异。

图4 不同番石榴叶样品的PCA得分Fig.4 PCA scores of different Psidii Guajavae Folium samples

依据PCA结果，对不同分布地区的2组样品进行OPLS-DA分析。OPLS-DA模型，R2Y(cum)=0.895，Q2(cum)=0.842，均大于0.5，说明模型稳定可靠，可用于不同产地样品的区分。从图5可以发现，数据的分类算法中OPLS-DA的效果较好，可使两类样本完全分开，相互之间没有样本出现交叉的情况，少部分样品在95%可信区间外。

图5 不同番石榴叶样品OPLS-DA得分图Fig.5 OPLS-DA scores of different Psidii Guajavae Folium samples

对OPLS-DA变量重要性投影值(variable importance in the projection，VIP)进行分析(见图6)，VIP值越大的变量(至少大于1)对分类的贡献越大。采用VIP>1.0作为标准筛选出对模型贡献较大的变量，分别为峰9、12、11、4、13、3、10，这些成分是引起番石榴叶因产地差异导致成分差异的主要标志性成分，其余峰VIP值<1，对样品产地区分影响较小。

图6 番石榴叶14个共有峰的VIP值Fig.6 VIP values of 14 common peaks of Psidii Guajavae Folium注：1～14：峰1～14。Note:1～14:Peak 1～14.

2.7 多成分含量测定

2.7.1 系统适应性

取混合对照品溶液、供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，鞣花酸、金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、番石榴苷与其相邻色谱峰的分离度大于1.5(见图2)。

2.7.2 线性关系考察

精密移取各对照品溶液，至5 mL容量瓶中，加甲醇配制成鞣花酸、金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、番石榴苷的混合对照品溶液，浓度分别为38.69、164.80、164.80、75.20、150.24 μg/mL，作为标曲最高浓度。精密移取混合对照品溶液1 mL，置2 mL容量瓶中，加入甲醇稀释并定容至刻度线，混匀。按照上述方法，依次制备得到不同浓度的混合对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样，以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线及线性回归方程(见表10)。

表10 线性回归方程及相关系数

2.7.3 精密度考察

根据“2.4.1”项下精密度考察试验，测得鞣花酸、金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、番石榴苷的峰面积RSD值分别为1.51%、1.50%、1.50%、1.51%、1.49%，表明仪器精密度良好。

2.7.4 重复性考察

根据“2.4.2”项下重复性考察试验，测得鞣花酸、金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、番石榴苷的峰面积RSD值分别为2.17%、0.85%、0.90%、2.05%、1.31%，表明该方法重复性良好。

2.7.5 稳定性考察

根据“2.4.3”项下稳定性考察试验，测得鞣花酸、金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、番石榴苷的峰面积RSD值分别1.14%、0.18%、0.36%、0.66%、2.37%，表明该供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.7.6 加样回收率试验

精密称取已知含量的S24番石榴叶药材6份，每份0.5 g，分别精密加入与样品中含量相当的鞣花酸、金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、番石榴苷对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，计算各成分的平均加样回收率，结果鞣花酸、金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、番石榴苷平均加样回收率分别为100.18%、98.17%、97.36%、100.64%、98.40%，RSD值分别为3.50%、2.99%、3.13%、4.29%、2.05%。

2.7.7 样品含量测定

根据“2.3”项下方法制备番石榴叶药材供试品溶液，每批平行3份，按“2.1”项下色谱条件进样，记录数据。测得鞣花酸、金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、番石榴苷的百分含量，具体结果见表11。

表11 31批番石榴叶药材多成分含量测定结果(n=3)

续表11(Continued Tab.11)

3 讨论

参照课题组前期研究[20]，确定提取方法为60%乙醇超声提取30 min，流动体系为乙腈-0.2%磷酸水，色谱柱(Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温35 ℃，进样体积10 μL。同时，考察波长(230、254、360 nm)及流动体系不同比例梯度洗脱对番石榴叶HPLC指纹图谱的影响。结果，本试验确定的色谱条件下，番石榴叶样品溶液峰数最多，HPLC基线平稳，峰形及分离度较好。

本试验收集了具有地域代表的番石榴叶药材，包括广东、广西、福建、海南、四川，保证了番石榴叶指纹图谱的广泛性。采用相似度评价对番石榴叶HPLC指纹图谱进行分析，发现31批番石榴叶的HPLC指纹图谱相似度存在一定差异，不同产地的番石榴叶药材质量受地域影响。

聚类分析与主成分分析结果一致，发现31批番石榴叶样品主要分为两类，广西、广东、福建、海南聚为一类，四川、云南聚为一类。根据中国地理分布图及行政区划发现四川、云南位于以大兴安岭、太行山脉、巫山及雪峰山的界限的第二阶梯(平均海拔1 000～2 000 m)，属于西南地区；广西、广东、福建海南位于以大兴安岭、太行山脉、巫山及雪峰山为界限的第三阶梯(平均海拔500 m以下)，属于沿海地区。利用正交偏最小二乘判别分析，发现引起此两类产地番石榴叶差异的7中主要成分，并鉴定出鞣花酸、金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、番石榴苷5种成分。通过对番石榴叶样品中鞣花酸、金丝桃苷、异槲皮素、瑞诺苷、番石榴苷进行定量分析，发现沿海地区(广东、广西、福建、海南)的5种成分含量均低于西南地区(四川、云南)，且有显著性差异(见图7)。综上，番石榴叶的次生代谢产物呈明显的地域差异，提示番石榴叶的药材质量与其生长环境密切相关，可能受当地的气候条件和环境因素影响，其具体影响因素还需进一步调查研究。

图7 31批不同产地番石榴叶药材的平均质量分数Fig.7 The average mass fraction of 31 batches of Psidii Guajavae Folium from different origins

本研究以番石榴叶为对象，采用高效液相色谱法，建立了番石榴叶药材的化学指纹图谱，测定了番石榴叶药材中鞣花酸、金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、番石榴苷5种化学成分的含量，并结合化学计量学方法分析了31批不同产地的番石榴叶药材，发现番石榴叶药材质量受地域影响。所建立的方法简便、准确，为番石榴叶药材的质量控制及质量标准的建立提供了方法及数据参考。