基于网络药理学和分子对接技术的生姜挥发油治疗头风病作用机制研究

晏 菲，高佳蓉，张小飞，邹俊波，贾妍卓，王雯翡，史亚军

陕西中医药大学药学院 陕西省中药基础与新药研究重点实验室，咸阳 712046

“头风”最早记载于《神农本草经》，“白鲜，味苦，寒。主治头风”。《症治准绳·头痛》云：“医书多分头痛头风为二门，然一病也，但有新久去留之分耳。浅而近者名头痛，其痛卒然而至，易于解散速安也。深而远者为头风，其病作止不常，愈后迁触复发也。”现代医学认为，头风病是一种慢性阵发性头痛为主要表现的疾病，相当于西医的偏头痛、紧张性头痛和丛集性头痛等原发性头痛。发病间歇期间状如常人，一旦受到诱因刺激，便头痛剧烈，每次发作性质相似，病程较长，容易反复发作。仅偏头痛一项在全球的发病率为8.4%～28%，终生发病率约为14.0%，大约18.2%的女性和6.5%的男性患有偏头痛[1]。偏头痛在全球的伤残调整生命年数(disability-adjusted life-years，DALYs)从1990年到2015年增加了49.5%，为仅次于卒中的第二大DALYs[2]。西医治疗以应用非甾体类抗炎药、曲普坦类药物、阿片类药物、麦角类制剂为主，但有较大的副作用，且易反复。传统口服中药服药时间长，且不能立即缓解症状。针灸治疗可疏通经络，改善患者血管内皮细胞功能，但仅能减轻疼痛强度，减少发作次数、缩短持续时间，需与药物结合才能起到更好的效果。

生姜是姜科多年生草本植物姜Zingiberofficinale Rosc.的新鲜根茎。味辛，性微温。具有解表散寒，温中止呕等功效[3]。我国传统医学使用生姜治疗头风病早有记载，《名医类案》曰：“以生姜自然汁少许，灌入鼻中，其痛立止”治疗顽固性头风痛。现代研究表明，生姜挥发油具有镇痛、兴奋与镇静，抗氧化和对缺血性脑损伤的保护作用，对中枢神经系统有兴奋和抑制的双向调节作用[4]。生姜挥发油脂溶性强，极性较小，而鼻黏膜为脂质膜，极性小、脂溶性强的物质易于通过，本研究拟将生姜挥发油制成鼻腔给药制剂，可经“鼻-脑” 通路向脑区高效递药而呈现显著的脑靶向作用[5]，应用网络药理学的方法分析生姜挥发油、头风病、靶点之间作用的关系，构建“化合物—靶点—通路—疾病”间的多层次网络关系，对生姜挥发油治疗头风病的作用机制进行探讨，为后期制剂研究提供一定的基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

BT-25S型十万分之一电子天平(赛多利斯上海贸易有限公司)；Agilent 7890B/5977B气相色谱-质谱(GC-MS)联用仪(美国安捷伦公司)。

生姜(购于陕西西安市农贸市场，经陕西中医药大学王继涛高级实验师鉴定为姜科姜属植物姜ZingiberofficinaleRosc.的新鲜根茎)。乙酸乙酯、无水硫酸钠为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 生姜挥发油化学成分的测定

照《中国药典》2020版一部生姜项下挥发油提取方法提取挥发油，生姜破碎成小块，加10倍量水，浸泡30 min，水蒸气蒸馏法提取6 h，收集挥发油，以适量乙醚溶解，无水硫酸钠脱水干燥后备用[6]。

采用GC-MS技术测定生姜挥发油的化学成分。气相色谱条件：Agilent HP-5 ms(30 m×250 μm×0.25 μm)毛细管色谱柱，载气为氦气，进样量1 μL，分流比5:1，分流流量5 mL/min，程序升温初始温度70 ℃(10 min)，10 ℃/min至95 ℃，5 ℃/min至125 ℃，6 ℃/min至240 ℃，1 ℃/min至260 ℃。质谱条件：EI离子源，离子源温度250 ℃，四极杆温度150 ℃，扫描质量范围(m/z)20～450 amu，溶剂延迟3 min，采用DataAnalysis将阈值调为21，筛选化学成分[7]。

1.2.2 生姜挥发油作用靶点的预测

利用GC-MS测定的生姜挥发油化学成分借助TCMSP和Swiss Target Prediction在线分析工具对生姜挥发油的靶点进行预测。

1.2.3 头风病疾病相关靶点的预测

头风病相当于现代医学的偏头痛、紧张性头痛、丛集性头痛等原发性头痛。为了较完全的预测头风病疾病的靶点，以头风病(head wind disease)、偏头痛(migraine)、紧张性头痛(tension headache)、丛集性头痛(cluster headache)作为关键词，在Drugbank、OMIM和DisGeNET数据库对头风病疾病相关靶点进行检索。

1.2.4 生姜挥发油化学成分—头风病疾病靶点的交集

将生姜挥发油化学成分的靶点与头风病疾病的靶点分别导入在线网站Venny 2.1.0中绘制维恩图，重叠部分为两者的交集，即生姜挥发油化学成分直接作用于头风病的靶点。

1.2.5 “成分—靶点”网络的构建

将生姜挥发油化学成分与1.2.4中的交集靶点分别导入Cytoscape 3.7.2软件中，构建生姜挥发油化学成分—交集靶点信息网络。在信息网络中，边表示蛋白与蛋白的相互关系，线条的粗细代表关联度等级。

1.2.6 蛋白—蛋白相互作用(PPI)网络的构建

将1.2.4中获得的交集导入String中获取PPI网络功能富集分析，将结果以TSV文件保存并上传至Cytoscape 3.7.2软件对靶点进行可视化分析，得到生姜挥发油治疗头风病靶点的PPI网络并对其进行拓扑分析。

1.2.7 GO富集分析与KEGG富集分析

R语言ClusterProfiler包[8]可以对基因集合进行统计分析和可视化。利用ClusterProfiler包对交集靶点进行GO和KEGG富集分析，得到与生姜挥发油治疗头风病生物过程、细胞组分、分子功能及主要通路等有关的富集项。

1.2.8 分子对接

利用Discovery Studio 4.0软件进行分子对接。在生姜挥发油治疗头风病靶点的PPI网络图中选取核心靶点，借助PDB数据库(https://www.rcsb.org/)找出靶点score值排序靠前的靶点蛋白结构，配体为该靶点所对应的化合物，利用Drugbank在线平台找出核心靶点对应的阳性药物并在Pub Chem中下载阳性药物和所对应化合物的2D结构。将整理好的靶点蛋白3D结构和对应化合物及阳性药物的2D结构导入Discovery Studio，使用DOCK ligand(libDock)进行分子对接，得到核心靶点蛋白和对应化合物及阳性药物的相互作用关系图。

2 结果

2.1 生姜挥发油的化学成分

通过GC-MS测定出生姜挥发油的化学成分有53种(见表1)，成分总离子谱图见图1。

表1 生姜挥发油化学成分

续表1(Continued Tab.1)

图1 生姜挥发油成分总离子谱图Fig.1 Total ion spectrum of ginger volatile oil

2.2 生姜挥发油化学成分作用靶点的收集

将生姜挥发油的化学成分在TCMSP和Swiss Target Prediction数据库进行作用靶点预测，共获得作用靶点3 816个，删除重复项，获取生姜挥发油化学成分靶点509个。

2.3 头风病基因靶点的收集

通过Drugbank、OMIM和DisGeNET数据库收集头风病疾病的基因靶点共1 507个，删除重复项，得到靶点915个。

2.4 生姜挥发油化学成分—头风病疾病靶点的交集结果

利用检索得到的生姜挥发油的509个靶点与头风病的915个疾病靶点绘制维恩图，得到交集基因130个(见图2)。说明生姜挥发油治疗头风病可能是通过这130个靶点发挥作用。

图2 生姜挥发油化学成分靶点与头风病疾病靶点维恩图Fig.2 Venn diagram of chemical component target of ginger volatile oil and head wind disease target

2.5 “成分—靶点”网络模型的构建

将2.4得到的交集靶点，导入Cytoscape 3.7.2软件中建立 “生姜化学成分—交集靶点”网络，网络由178个节点组成1 400条边，其中最大自由度值为86，平均自由度为14.034(见图3)。图中左边浅蓝色三角代表生姜挥发油的化学成分，右边红色圆圈代表药物—疾病的交集靶点，大小根据自由度排序，展示成分与各交集靶点之间的关系。

图3 “生姜挥发油化学成分-交集靶点”网络图Fig.3 Network diagram of "chemical component of ginger volatile oil-intersection target"

2.6 PPI网络构建

利用String网站对130个交集基因进行分析，通过Cytoscape 3.7.2软件对分析得到的数据进行可视化分析，得到生姜挥发油治疗头风病靶点的PPI网络并进行拓扑分析。根据度的大小得到62个主要节点，642条边，平均自由度为16.726(见图4)。即62个头风病相关的关键靶点和642条与头风病靶点蛋白质相互作用关系，图中每个圆圈代表每个交集靶点，大小及颜色深浅显示其自由度的大小。

图4 生姜挥发油治疗头风病的靶点PPI网络图Fig.4 PPI network of ginger volatile oil in the treatment of head wind disease target

在生姜挥发油治疗头风病作用PPI网络中，APP、OPRM1、ADRA2A、ADRA2C、HTR1A、DRD2、DRD4、DRD3、ADRA2B、OPRK1是度值最大的10个节点，即生姜挥发油治疗头风病的关键靶点，可能在生姜挥发油治疗头风病的过程中具有重要作用。

2.7 GO富集分析与KEGG富集分析

2.7.1 生物过程(BP)分析

对生姜挥发油治疗头风病的潜在靶点进行GO分析，BP分析得到1 148个富集项，按照显著性大小排序，前20项最具显著性的BP见图5，生姜挥发油治疗头风病和与环核苷酸第二信使偶联的G蛋白偶联受体信号通路、血管管径调节、循环系统中的血管突起、腺苷酸环化酶调节G蛋白偶联受体信号通路、血管内径负调控等生物过程密切相关。通过Clusterprofiler包构建BP分析GO交互网络(见图6)，图中大红色节点代表着更显著的路径。

图5 生姜挥发油治疗头风病潜在靶点GO富集分析(BP)Fig.5 GO enrichment analysis of potential targets of ginger volatile oil in the treatment of head wind disease(BP)

图6 生物过程(BP)重点通路图Fig.6 Key pathway map of biological process

2.7.2 细胞组分(CC)分析

CC分析得到72个富集项，前20项最具显著性的CC见图7，生姜挥发油治疗头风病与突触后膜、突触膜、突触后膜的组成部分、突触后膜的固有成分以及突触膜的整体成分等细胞组分密切相关。CC分析GO交互网络见图8。

图8 细胞组分重点通路图Fig.8 Key pathway map of cellular component

2.7.3 分子功能(MF)分析

MF分析得到141个富集项，前20项最具显著性的MF见图9，生姜挥发油治疗头风与G蛋白偶联胺受体活性、神经递质受体活性、G蛋白偶联神经递质受体活性、5-羟色胺受体活性等分子功能密切相关。MF分析GO交互网络见图10。

图9 生姜挥发油治疗头风病潜在靶点GO富集分析(MF)Fig.9 GO enrichment analysis of potential targets of ginger volatile oil in the treatment of head wind disease(MF)

图10 分子功能重点通路图Fig.10 Key pathway map of molecular function

2.7.4 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集结果见图11，共得到77个富集项，前20项最具显著性的通路见图8。结果显示，神经活性配体—受体相互作用通路是最显著的代谢通路，可能是生姜挥发油治疗头风病最重要的通路，Ca2+信号通路、含血清素的神经突触、cAMP信号通路、cGMP-PKG信号通路等可能是较重要的通路。血清素5-羟色胺(5-HT)是含血清素的神经突触通路中发挥作用的重要物质，作用过程见图12。

图11 生姜挥发油治疗头风病潜在靶点KEGG通路富集分析Fig.11 KEGG pathway enrichment analysis of potential targets of ginger volatile oil in the treatment of head wind disease

图12 生姜挥发油治疗头风病的重要通路-含血清素的神经突触Fig.12 An important pathway of ginger volatile oil in the treatment of head wind disease-serotonergic synapse

2.8 分子对接分析

为了进一步说明靶点蛋白与对应化合物之间的结合活性，本研究选择生姜挥发油治疗头风病作用蛋白交互网络中度值较高的3个核心靶点OPRM1、ADRA2A和DRD2，与其对应的化合物进行分子对接，结合活性越高，得分越高(见表2)。其中橙花叔醇与OPRM1，可巴烯与ADRA2A，金合欢醛与DRD2的结合活性最高。利用Discovery Studio 4.0软件进行阳性药物验证实验和分子对接，并选择与表2中对接得分最高的化合物即核心成分进行比较，对比情况见表3。核心靶点与核心成分、阳性药物的对接结果见图13。结果表明，3个核心靶点与核心成分的对接得分均高于与阳性药物的对接得分。

图13 核心靶点与核心成分、阳性药物分子对接图Fig.13 Molecular docking results of core targets combined with core components and positive drugs注：A.OPRM1-橙花叔醇；B.OPRM1-吗啡；C.ADRA2A-可巴烯；D.ADRA2A-溴莫尼定；E.DRD2-金合欢醛；F.DRD2-阿朴吗啡。Note:A.OPRM1-Nerolidol;B.OPRM1-Morphine;C.ADRA2A-Copaene;D.ADRA2A-Brimonidine;E.DRD2-2,6,10-Dodecatrienal,3,7,11-trimethyl-,(E,E)-;F.DRD2-Apomorphine.

表2 核心靶点与对应化合物结合活性得分表

表3 核心靶点与核心成分、阳性药物的结合活性得分对比

3 讨论

中医学认为，头风病其病因为内感和外伤两端，临证时难以用单一病机概括，为风、瘀、寒、痰、虚杂合致病。《诸病源候论》谓“头面风者，是体虚，诸阳经脉为风所乘”。风邪为最主要的致病因素，与头风病的发作与反复有密切关系。Wu等[9]整理了秦汉至晚清1911年现存的治疗头痛的古代医学论著及文献资料，解表药及辛味药物使用频次为最高，以解表药祛除外感风寒或风热，其中生姜在所有药物中的使用频次占第5位。

本研究运用网络药理学对生姜挥发油的主要活性成分、作用靶点进行筛选并与头风病的靶点进行交集，建立生姜挥发油化学成分—交集靶点信息网络进行生姜挥发油治疗头风病的研究。研究表明，生姜挥发油治疗头风病的主要活性物质是乙酸龙脑酯、合成右旋龙脑、α-松油醇、eudesma-4,6-二烯、橙花叔醇、柠檬醛、可巴烯以及β-桉叶醇等。通过PPI网络分析筛选出APP、OPRM1、ADRA2A、ADRA2C、HTR1A、DRD2、DRD4、DRD3、ADRA2B、OPRK1等62个可能在生姜挥发油治疗头风病过程中发挥重要作用的关键靶点以及642条头风病靶点蛋白质相互作用关系。

为进一步探讨生姜挥发油治疗头风病的潜在机制，利用生姜挥发油活性成分和头风病疾病的交集靶点进行了GO和KEGG富集分析。GO富集分析共得到1 361个富集项，包括生物过程中与环核苷酸第二信使偶联的G蛋白偶联受体信号通路、血管管径调节、循环系统中的血管突起等；细胞组分中的突触后膜、突触膜、突触后膜的组成部分等；分子功能中的G蛋白偶联胺受体活性、神经递质受体活性、G蛋白偶联神经递质受体活性、5-羟色胺受体活性等。KEGG富集分析得到了77个富集项，包括神经活性配体—受体相互作用通路、Ca2+信号通路、含血清素的神经突触通路等。头风病的发生与多种神经递质及受体有关，其为阵发性神经系统疾病，可通过调节神经活性配体—受体相互作用通路发挥镇痛作用[10]。文献研究表明，偏头痛与Ca2+信号通路密切相关，抑制性突触在调节疼痛信号传导和偏头痛产生的调制电路中起着关键作用，P/Q型Ca2+通道通常对许多中枢突触的突触前Ca2+进入和神经递质释放至关重要，能够抑制或兴奋神经传递[11]。含血清素的神经突触又称5-HT神经通路，其与控制进食行为，体温调节和睡眠等有关。偏头痛患者5-HT受体结合率降低，脑内5-HT水平升高，许多抗偏头痛药物与5-HT及其受体相互作用从而发挥治疗作用[12,13]。富集分析结果显示，生姜挥发油可能通过调节关键靶蛋白，参与神经活性配体—受体相互作用，Ca2+信号通路以及含血清素的神经突触等相关通路发挥镇痛治疗作用。

为进一步说明蛋白与相应配体化合物的结合活性，结合文献报道，在生姜挥发油治疗头风病作用PPI网络度值较大的靶点中选取3个核心靶点OPRM1、ADRA2A、DRD2，在Drugbank里找出与蛋白有关的3个阳性药吗啡、溴莫尼定、阿朴吗啡，配体即为该蛋白所对应的成分化合物。利用Discovery Studio 4.0对该蛋白和配体及阳性药进行分子对接，结果表明，该蛋白与配体的结合活性分数高于与阳性药的结合活性分数，即蛋白与配体的结合活性较高。在核心靶点中，OPRM1基因是μ阿片受体的编码基因，μ阿片受体在机体的痛觉敏感性和内源性镇痛等功能中发挥重要调节作用，尤其在调控神经系统产生镇痛效应方面有非常重要的作用[14]。ADRA2A属于G蛋白偶联受体，存在于去甲肾上腺素神经元中，刺激和抑制突触后中枢神经系统信号通路[15,16]。ADRA2A受体的激活会产生选择性的颅脑血管收缩作用[17]。DRD2主要位于脑部，是黑质纹状体多巴胺能神经元的主要靶点[18]。偏头痛患者发作期内源性多巴胺释放减少和波动[19]。DRD2基因多态性与中国汉族女性偏头痛的发病风险显著相关，偏头痛患者血浆DRD2水平较高，女性偏头痛患者的DRD2水平明显高于男性偏头痛患者[20]。

本研究应用网络药理学的方法证实了生姜挥发油治疗头风病的作用，预测了生姜挥发油治疗头风病的潜在靶点以及治疗头风病作用相关的信号通路和生物过程，揭示了生姜挥发油治疗头风病是多成分、多靶点、多通路的作用结果。本研究对生姜挥发油治疗头风病的作用机制及实验验证提供了理论依据，以期对后期的制剂研究、药物开发和临床应用提供参考。