基于数据挖掘和网络药理学分析《中国药典》治疗心悸药物配伍规律及其作用机制

2021-07-07徐宁阳杨关林

天然产物研究与开发 2021年6期

徐宁阳，王群，刘悦，张哲，杨关林*

1辽宁中医药大学，沈阳 110847；2辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110032

心悸是中医病证名，《伤寒杂病论》称之为 “心动悸”“心下悸”“心中悸”“惊悸”。患者自感为悸动不安、惊惕心慌甚至不能自主。情志不遂或者过度劳累时易发作，多伴有气短、耳鸣、眩晕、胸闷、憋气等症状。根据症状心悸在西医中属于心律失常范畴，是我国最为常见的心血管疾病类型，具有高发生率、死亡率，疾病临床类型较多，常见有心动过速、心动过缓、心房颤动、传导异常等[1,2]。如果不加以控制，不仅会对心肌细胞造成不可逆的损伤，还会引发心肌梗死等严重并发症，对患者的生活有着难以改善的影响，降低患者的生活质量的同时也会危急患者的生命。目前西医治疗多以抗心律失常药物治疗，但大量实践表明仍有患者对西医治疗会产生复发或者药物不能耐受等不良后果[3]。近几年由于中医药在临床治疗中广泛应用，故有学者提出以中药治疗心律失常，心悸最早由张仲景提出，因此通过古代的中药研究，如何能更好的医治心悸，其具体分子靶点是怎样的，本研究将从2015年《中国药典》(一部)(以下简称《中国药典》)入手，挖掘《中国药典》中用于治疗心悸中成药的组方规律，分析出高频药物。

《中国药典》是将药品从研制到生产、从经营到使用管理等相关从业者必须遵守的法定依据，是我国保证药品质量的法典。在前期文献研究中发现有关学者已对药典所收载的中药饮片或毒性药材展开归类及配伍规律的研究[4]；对收载的成方制剂开展主治病证的中成药组方规律分析[5,6]；对《中国药典》收载的成方制剂和单味制剂进行系统数据挖掘，但均未发现对治疗某一相关疾病尤其心血管疾病的中成药进行数据挖掘及分析规律，故本研究以2015年版《中国药典》中的治疗心悸的中成药的方剂名称、中药成分、中药用量、功能与主治为研究对象，采用由中国中医科学院中药研究所研发的V2.5版中医传承辅助平台分析用药规律[7,8]，通过其主要功能关联规则Apriori算法、复杂系统熵聚类等无监督数据挖掘方法，分析中药的使用频次及中药之间的关联规则、处方规律以及新方的预测。

由上述软件分析得出的用药规律后，得出治疗心悸的高频药物，通过由Hopkins等人提出的探索中药与疾病直接关系的科研方法—网络药理学，系统的分析和挖掘，构建“中药-有效成分-疾病靶点-疾病”之间的关系，能够为中药机制分析及药物研发提供新思路、新方法[9,11]。由于中药具备多成分、多靶点的因素，所以网络药理学正是能够更好的阐述中药作用于心悸的作用机制。

1 资料和方法

1.1 治疗心悸的中成药收集

检索2015年《中国药典》(一部)中成方制剂与单位制剂部分的药品说明书，在功能与主治中选取关键词为：“心悸”“心律失常”等字样用于治疗心悸的中成药。在选取后的中成药中排出剂型不同但药方一致的方剂，如：归脾丸、归脾合剂、归脾颗粒计为1个中成药。

1.2 数据的录入、核对与处理

在《中国药典》中，将符合“1.1”条件的中成药方中的方剂名称、中药成分、中药用量、功能与主治录入Microsoft Excel for Mac；对所纳入的中药的名称进行统一规范，如：沙棘鲜浆规范为沙棘、醋龟甲规范为龟甲。将所涉及的藏药，蒙药，苗药或者中药为同一药材但名称不同的，按照中国药典及十三五规划的中药学教材标准统一录入。规范后的数据录入中医传承辅助平台V2.5，采用两人输入，第三人校对审核，确保数据严谨、真实。

1.3 数据分析

1.3.1 中医药传承辅助平台对用药规律的分析与预测

将“1.2”所录入的数据在中医药传承辅助平台V2.5相应模块中进行“频次统计”，“组方规律”，“新方分析”的用药规律分析及预测。

1.3.2 网络药理学对药物的深度分析

将“1.3.1”中所得到的最高频药物，在中医药系统药理学平台(The Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)[12]先后进行中药有效成分筛选，同时在GeneCards数据库以心律失常(arrhythmia)为关键词，检索心悸的相关疾病靶点，再使用Draw Venny Diagram在线程序构建中药-疾病交集靶点，在Cytoscape 3.7.1中构建药物-疾病-靶基因网络图，并将基因提交至String网站绘制蛋白质相互作用关系图(PPI)，再利用R3.6.1软件进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，来预测《中国药典》中治疗心悸的最高频药物的可能作用机制。

2 结果

2.1 药频统计--治疗心悸的中成药中各中药的使用频率

在《中国药典》中共选取到93个中成药方，其中14个为剂型不同但存在药方一致，故剩余79个有效中成药方。根据《中国药典》，对79个有效中成药中的176味中药进行“频次统计”，得到应用频次不少于8的中药22个，其中用药频次最高的五位药分别是：丹参31次；人参23次；麦冬18次；川芎和五味子各17次。详见表1。

表1 《中国药典》中治疗心悸的中成药的用药频次(≥8次)

2.2 关联分析--治疗心悸处方的组方规律分析

2.2.1 《中国药典》中治疗心悸常用药对分析

根据Apriori算法，在设置支持度为7的情况下，得到25个高频药对。其中，出现频度最高的四对配伍分别是：丹参-人参13次；川芎-丹参12次；麦冬-五味子和丹参-五味子各10次(详见表2)。

表2 《中国药典》中治疗心悸处方中高频药对

续表2(Continued Tab.2)

2.2.2 《中国药典》中治疗心悸药物应用规则分析

同样在Apriori算法中，设置置信度0.6，得到9种应用规则，其中石菖蒲->丹参；红花->川芎；当归、远志->酸枣仁的置信度最高，为0.875。规则详见表3和图1。

表3 《中国药典》中治疗心悸药物规则分析

图1 《中国药典》中治疗心悸药物关联规则可视化Fig.1 Visualization of association rules of drugs for treatment of arrhythmia in the Chinese Pharmacopoeia

2.3 聚类分析--基于熵聚类方法的新处方预测

在应用“新方分析”模块中，设置相关度8，惩罚度2，通过无监督的熵层次聚类分析，得到核心组合16个，见表4。并进一步分析得到用于治疗心悸新方组合10个(见表5，图2)。

图2 《中国药典》中治疗心悸药物新处方网络展示图Fig.2 Network display diagram of new prescriptions for arrhythmia in the Chinese Pharmacopoeia

图3 丹参活性化合物靶点与心悸靶点的交集基因Fig.3 Intersection genes between the target of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma active compound and the target of arrhythmia

图4 丹参与心悸蛋白质相互作用核心网络图Fig.4 The core network diagram of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma involvement in arrhythmia protein interaction

表4 《中国药典》中治疗心悸药物聚类核心组合

表5 《中国药典》中治疗心悸药物新处方预测结果

2.4 网络药理学分析--高频药物丹参治疗心悸的潜在作用机制分析

2.4.1 丹参的靶标预测结果

根据“2.1～2.3”所得到的最关键性药物丹参进行网络药理学分析。在TCMSP中预测到丹参的65个有效成分(筛选要求OB大于30%，DL大于0.18[13,14])。具体信息见表6。

表6 丹参的有效成分表

2.4.2 丹参治疗心悸的蛋白、基因分析

将TCMSP中得到的药物靶点和在GeneCards数据库中得到的疾病靶点进行交集基因预测，其中有79个交集靶点(见图3)。在String网站中，生成PPI互作网络图(见图4)。并根据其蛋白质-蛋白质作用数量，生成蛋白统计条图(见图5)。最后对65个中药靶点(蓝色)及79个疾病靶点(绿色)构建丹参-有效成分-疾病靶点-疾病的网络图，交集线比较集中的部分可能是其关键靶点，整个网络中包括138个节点，642条边，degree排名前五名的化合物有木犀草素(luteolin)、丹参酮(tanshinone)、4-亚甲丹参新酮(4-methylenemiltirone)、隐丹参酮(cryptotanshinone)、鼠尾草酚酮(salviolone)，排名前五的基因有环加氧酶(PTGS2)、β2肾上腺素能受体(ADRB2)、人源全长重组蛋白(SCN5A)、阿片受体编码基因(OPRM1)、毒蕈碱型胆碱受体M1(CHRM1)(见图6)。

图5 蛋白统计条图Fig.5 Protein statistics bar graph

图6 丹参-有效成分-靶点-疾病网络图Fig.6 Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma-active ingredients-targets-disease network diagram

续表6(Continued Tab.6)

2.4.3 丹参治疗心悸的通路可视化富集分析

为了进一步探究丹参对于心悸的作用功能及通路，利用R3.6.1软件进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，其中GO生物学功能分析得到结果见图7。KEGG通路富集分析得到PI3K-AKT信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等通路(见图8)。

图7 GO生物学功能富集分析图Fig.7 Analysis diagram of GO biological function enrichment

图8 KEGG通路富集分析图Fig.8 KEGG pathway enrichment analysis diagram

3 讨论

心律失常作为比较常见的心系疾病，是临床心血管疾病常见症状，不及时治疗可致恶性心律失常，严重者危及生命安全。中医在治疗心悸有着很好的疗效。因此笔者在《中国药典》中选取心悸进行数据挖掘与分析，得到高频药物丹参、人参、麦冬、川芎、五味子等。其中丹参，人参，麦冬等药在Ling和Hao等[15,16]的心悸用药规律分析中也是高频用药。虽然丹参是本文挖掘出的最高频药物，但这些高频药物又是如何作用在心律失常疾病的机理上，故本文后续通过网络药理学平台对丹参治疗心律失常进行了靶点分析。

3.1 心律失常疾病靶点分析

通过研究心律失常疾病的靶点中，发现心律失常与离子通道基因表达异常紧密相关，多个离子通道基因的突变可引起各种心律失常。目前，已知绝大多数的原发性心电异常都是由编码各主要离子通道亚单位的基因突变引起的，统称“离子通道病”。Nav1.5通道是人类主要的心脏钠离子通道类型，由SCN5A基因编码。近年来发现SCN5A基因突变与房性心律失常，室性心律失常，病态窦房结综合征密切相关[17]。不仅如此，研究表明像ESR等靶点也能诱发心律失常[18]。除此之外，微循环障碍会对心血管造成影响，引发相关心血管疾病，因此有研究表明，丹参治疗微循环障碍也主要体现在PTGS2上等[19]，不仅如此，也有相关研究表明，在丹参治疗冠心病相关靶点中也与PTGS2、PTGS1密切相关[20]。并且丹参的活性化合物分子与相关心血管疾病治疗密切相关，丹参通过作用于多个靶点来发挥药理学作用，主要体现在PTGS1、PTGS2、ADRA1A、ADRA1B、CHRM2中[21]。

3.2 丹参治疗心律失常的活性化合物预测

在我国丹参作为活血祛瘀之要药，在治疗心血管疾病已有两千多年的历史，丹参活性成分及丹参制剂具有一定的抗动脉粥样硬化、改善心肌重构、抗心肌缺血、抗心律失常的心血管保护作用。但对心律失常的报道还是鲜见，通过本研究中发现，在预测的活性化合物中，丹参酮ⅡA通过减少体内MDA含量、加强SOD活力从而提高HUVEC细胞抗氧化应激损伤能力，降低细胞自噬水平达到保护血管的作用[22]，同时Sun等[23]研究发现，丹参酮IIA是一种特异性激活剂，可用于预防和治疗由心肌细胞动作电位复极延迟和IKs通道功能降低引起的心律失常。不仅是丹参酮IIA，在丹参的活性化合物中丹酚酸B同样重要，研究发现，丹酚酸B具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抑制细胞凋亡等多种药理活性，在临床可广泛用于治疗心脑血管疾病[24]。因此通过药理学发现丹参的许多化合物都可以预防甚至治疗心律失常。

3.3 丹参治疗心律失常的信号通路研究

影响心律失常的原因有很多，其中心肌缺血再灌注后发生的心律失常是重要的临床表现形式，因此提高心肌细胞的抗氧化能力，抑制细胞的过度自噬显得非常重要，在这个过程中，药理学研究发现可以上调PI3K信号通路的表达，进一步上调Akt和mTOR的表达，也就是通过PI3K/Akt/mTOR信号通路起到抗心肌缺血再灌注损伤致心律失常的作用[25]。不仅如此，在免疫应答方面，T辅助型细胞为T细胞的一种，主要有Th1、Th2及Th17三个亚型。其中Th17主要分泌IL-17、IL-17F等。大量实验证明IL-17信号通路参与了心脏纤维化的进程[26]，而相关基础研究也证实了IL-17参与了AngII诱导的心房纤维化，对心律失常的产生有促进作用。同时对于TNF通路而言，对心律失常相关研究报道鲜有发生，但发现其能够通过诱导诱导型一氧化氮合酶的表达，从而导致微血管内皮细胞凋亡[27]，只能说TNF通路与微循环障碍的发生、发展密切相关，又因微循环障碍可能与心血管疾病有关，故可能对心律失常有影响。