肺结核病人外周血长链非编码RNA MIR155宿主基因的表达研究

梁伊乐，胡新俊，岳峰，徐芸

肺结核属临床常见传染病，中国当前逐年呈上升趋势，发病机制复杂，其中多种免疫细胞、因子参与其中。由于肺部感染类疾病症状类似，肺结核早期临床特征不明显且不出现较高特异性，在诊治时极易出现误诊或漏诊，从而影响肺结核的治疗。因此寻找较高特异性的因子有利于诊断肺结核。长链非编码RNA（long noncoding RibonucleicAcid，LncRNA）在疾病诊断中有一定应用，长链非编码肺腺癌转移相关转录本1（LncRNAMALAT1）在诊断肺结核中具有一定价值，但MALAT1与免疫之间是否有关尚不明确，长链非编码RNA MIR155宿主基因（LncRNAMIR155 HG）在哮喘病人中差异表达，影响哮喘。但LncRNA MIR155HG在肺结核中的研究尚未发现。因此，本研究拟通过研究肺结核外周血中LncRNA MIR155HG的情况，以及与T细胞相关基因的关系，为肺结核的诊断提供新的靶位点，具体结果如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2018年1月至2019年1月河南科技大学第一附属医院及洛阳市传染病医院就诊的肺结核（肺结核组）治疗病人126例，其中男85例、女41例；年龄范围18～80岁，年龄（49.56±19.52）岁。同时取150例体检健康者为对照组，其中男100例、女50例；年龄范围19～80岁，年龄（50.62±18.56）岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义（

χ

=0.020、

P

=0.889，

t

=0.462、

P

=0.645），具有可比性。

肺结核诊断标准：所有病人均符合《肺结核诊断和治疗指南》中关于肺结核的诊断标准。纳入标准：①均符合肺结核上述诊断标准；②确诊为肺结核病人；③年龄＞18岁。排除标准：①激素使用病人；②合并糖尿病等免疫器官缺陷病人；③其他因素影响免疫功能病人。

所有病人或其近亲属知情同意，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 外周血血样采集

健康对照组于体检时早晨、肺结核病人入院后第二空腹状态下抽取外周静脉血5 mL于肝素抗凝管中。平均分成两管，一管用于LncRNA MIR155HG的检测，-20℃冰箱保存；另一管抽血当天检测相关T细胞水平。

1.3 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测外周血中LncRNA MIR155HG水平

从-20℃冰箱中取出外周血，TRIZoL（美国ThermoFisher，货号S0001）法提取总RNA，cDNA反转录试剂盒（美国Fermentas，货号K1622）反转录cDNA，qRT-PCR仪（美国ABI，型号4376600）对LncRNA MIR155HG、内参β肌动蛋白（β-actin）扩增。引物序列：MIR155HG，正向引物5’-TGGAACAAATTGCTGCCGTG-3’，反向引物5’-AGGTTGAACATCCCAGTGACC-3’；β-actin：正向引物5’-AACTCCATCATGAAGTGTGACG-3’，反向引物5’-GATCCACATCTGCTGGAAGG-3’。上样体积20 μL，体系：2×SYBR

Premix Ex Taq

ⅡProbe QPCR Mix 10μL，cDNA 1μL（50 ng/μL），F/R（10μM）各0.5μL，双蒸水8.0μL。反应条件：95℃、60 s，94℃、30 s，62℃、45 s，45个循环。2法对LncRNA MIR155HG、内参β-actin表达水平定量分析。

1.4 酶联免疫吸附（ELISA）法检测外周血中T细胞指标白介素（Interleukin，IL）-2、干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）、IL-4、IL-5、辅助性T细胞17A（Th-17A）水平

人ELISA IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5（美国abcam，货号分别为ab46036、ab46025、ab215089、ab215536）、Th-17A（赛默飞世尔科技有限公司，货号29-8179-65）试剂盒检测外周血中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、Th-17A水平，操作按试剂盒具体步骤进行。

2 结果

2.1 两组外周血中LncRNA MIR155HG水平

肺结核组和对照组外周血中LncRNA MIR155HG相对表达量OD值分别为1.96±0.62、1.02±0.26，与对照组相比，肺结核组外周血中LncRNA MIR155HG水平升高（

t

=15.882，

P

＜0.05）

2.2 两组外周血中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、Th-17A水平

与对照组相比，肺结核组外周血中IL-2、IFN-γ降低（

P

＜0.05），IL-4、IL-5、Th-17A升高（

P

＜0.05）。见表1。

表1 肺结核病人126例与体检健康者150例外周血中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、Th-17A水平比较/（pg/mL，±s）

2.3 肺结核病人外周血中LncRNA MIR155HG与IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、Th-17A的关系

Pearson法分析结果显示，肺结核病人外周血中LncRNA MIR155HG与IL-5相关性不明显（

P

＞0.05），与IL-2、IFN-γ呈负相关（

P

＜0.05），与IL-4、Th-17A呈正相关（

P

＜0.05）。见表2。

表2 肺结核病人外周血中LncRNA MIR155HG与IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、Th-17A的关系

2.4 影响肺结核的多因素分析

将肺结核是否发生为因变量，以LncRNA MIR155HG、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、Th-17A为水平自变量进行多因素logistic回归分析，结果显示LncRNA MIR155HG、IL-4是影响肺结核的危险因素，IFN-γ是影响肺结核的保护因素，见表3。

表3 影响肺结核的多因素分析

2.5 外周血中LncRNA MIR155HG诊断肺结核的效能

ROC曲线显示，外周血中LncRNA MIR155 HG水平预测肺结核的ROC曲线下面积为0.920（95%

CI

：0.880～0.960），截断值为1.358，其敏感性为87.3%、特异性为99.2%。见图1。

图1 外周血中LncRNA MIR155HG预测肺结核ROC曲线图

3 讨论

肺结核在中国发病率逐年上升，感染人群广、且男性多于女性。临床以咳嗽、咳痰、发热、咯血、胸闷、胸痛等为首发症状，与肺炎、肺肉瘤样癌等其他呼吸疾病症状类似，缺乏特异性，病人多因出现临床症状而就诊，及早判定病情对于疾病治疗安全有效。肺结核是结核分支杆菌感染肺部所致，且会引起多种并发症和合并症，使病人免疫功能下降，而免疫功能可反映机体对疾病的抵抗力水平，免疫功能降低使病人自身对疾病的调节能力减弱，结核分枝杆菌感染肺部加重，从而导致肺结核加重。

LncRNA是一类长度大于200 nt的非编码RNA，与肺结核疾病关系密切，欧青叶等已经通过LncRNA芯片技术高通量检测筛选出潜伏性结核感染者血浆中多种LncRNA，但具体发挥的功能却尚不明确。Wang X等发现LncRNAH19靶向调控miR-22可抑制细胞的衰老、促进细胞增殖从而促进疾病发展；黄自坤等都对LncRNA MALAT1在结核感染病人中进行研究，发现LncRNAMALAT1可在肺结核中具有一定的诊断价值。LncRNA MIR155HG是一段长1 500 bp的LncRNA，因是miR-155的 宿 主 基 因 而 得 名。LncRNA MIR155HG在慢性心力衰竭中与心衰有一定关系，可反映病人心力衰竭程度；在系统性红斑狼疮中高表达，与疾病的活动度有关，可能诱发炎症，可作为系统性红斑狼疮活动度评估和预后判断指标。LncRNA MIR155HG在肺结核病人中尚无发现相关研究。本研究通过qRT-PCR检验肺结核病人外周血中的LncRNA MIR155HG水平，发现LncRNA MIR155HG在肺结核病人外周血中水平升高，是否可作为诊断指标需进一步验证。

T细胞是人体免疫系统的关键组成部分。Th1、Th2在肺结核免疫反应中研究广泛，可对结核分支杆菌感染的肺结核起保护作用。Th1主要对抗细胞内细菌和原虫的免疫反应和迟发性超敏反应，主要分泌IL-2、IFN-γ等，其中IFN-γ是特征因子；Th2细胞可辅助B细胞分化参与体液免疫，主要分泌IL-4、IL-5等，其中IL-4是特征因子，当机体受到异己抗原攻击时Th1细胞功能减弱、Th2细胞功能增强即可引起异常免疫应答。Th17主要分泌Th17A，在肺结核中水平升高导致感染细菌数量减少。本研究显示肺结核组外周血中IL-2、IFN-γ降低，IL-4、IL-5、Th-17A升高，肺结核病人外周血中Th1水平降低、Th2水平升高机体发生异常免疫应答，Th17水平升高可能降低结核分支杆菌感染肺结核的数量从而缓解疾病。

肺结核中影响LncRNA影响T细胞从而疾病已有报道，但具体关系尚不清楚。本研究发现肺结核病人外周血中LncRNA MIR155HG与IL-2、IFN-γ呈负相关，与IL-4、Th-17A呈正相关。提示肺结核病人外周血中LncRNA MIR155HG与Th1、Th2、Th17免疫功能关系密切，可能影响这些免疫功能细胞从而影响疾病。同时发现LncRNA MIR155HG、IL-4是影响肺结核的危险因素，IFN-γ是影响肺结核的保护因素。LncRNA MIR155HG、IL-4水平升高，IFN-γ水平降低均有可能发生肺结核。进一步研究ROC曲线显示，外周血中LncRNAMIR155HG水平预测肺结核的ROC曲线下面积为0.920，截断值为1.358，其敏感性为87.3%、特异性为99.2%。当ROC曲线下面积大于0.900时，具有较高的诊断价值。LncRNA MIR155HG对于诊断肺结核诊断价值较高，当外周血中LncRNA MIR155HG水平高于1.358时发生肺结核的概率较高。

综上所述，肺结核病人外周血中LncRNA MIR155HG水平升高，与T细胞关系密切，是肺结核的危险因素，同时对肺结核具有较高的诊断价值，有望成为肺结核诊断及预后预测的潜在标志物。本研究中发现LncRNA MIR155HG与T细胞有关，具体机制尚不明确，有待下一步深入探究。