高效液相色谱法测定盐酸伐地那非原料药中的有关物质

黄美容，曹阳，黄顺旺，曹明成

盐酸伐地那非，英文名为Vardenafil hydrochloride，CAS：224785-91-5，化学名为2-［2-乙氧基-5-（4-乙基-哌嗪-1-磺酰基）苯基］-5-甲基-7-丙基-3H-咪唑［5，1-f］-［1，2，4］三联氮-4-酮单盐酸盐，于2003年8月在美国获得批准上市，它是由德国拜耳和葛兰素史克公司共同开发研制，伐地那非对PDE5的抑制作用远远高于对其他PDE的作用（高于PDE6的1.5倍，PDE1的130倍，PDE11的300倍）。适应症：治疗男性阴茎勃起功能障碍（ED），其作用机制是通过抑制人体阴茎海绵体内降解cGMP的磷酸二酯酶5型（PDE5），增加性刺激作用下海绵体局部内源性的一氧化氮的释放，使得平滑肌松弛，增加人体阴茎海绵体血流，最终作用于阴茎海绵体，使海绵体平滑肌舒张，促进勃起。最新文献报道，伐地那非还具有治疗慢性前列腺炎、肺动脉高压等作用。

盐酸伐地那非的合成是以邻乙氧基苯甲脒盐酸盐、N-乙基哌嗪等为起始物料，经过取代、缩合、环合、磺酰化、取代和成盐等一系列化学反应制成盐酸伐地那非。本实验结合合成工艺路线及降解途径分析，对以下杂质进行定量研究。

目前，国内相关文献报道，均是采用乙腈-醋酸铵溶液体系，测定盐酸伐地那非原料药及制剂中的有关物质且最多控制了5个已知杂质（杂质A、杂质B、杂质C、杂质F、杂质G，各杂质结构见图1）。本实验采用乙腈-磷酸三乙胺缓冲液体系，新增了2个杂质（杂质D、杂质E，杂质结构见图1），进行梯度洗脱，结果7个杂质峰之间、杂质与主成分（盐酸伐地那非结构见图1）峰之间的分离度均符合要求（≥1.5），其灵敏度好、准确度高，可作为原料药有关物质检查的测定方法。该研究尚未见文献报道。

图1 盐酸伐地那非及各杂质结构示意图

1 仪器与试药

仪器：AG135电子天平、XP-6电子天平（METTLER TOLEDO）；LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津），SPD-20A检测器，SIL-20AC进样器，岛津LabSolutions DB Essentia工作站。试药：盐酸伐地那非对照品（批次20190301-J，99.7%）、杂质A（批次20190101，98.6%）、杂质B（批次20190112，98.4%）、杂质C（批次20190124，98.2%）、杂质D（批 次20181214，98.4%）、杂质E（批次20181226，97.6%）、杂 质F（批 次20181206，99.2%）、杂 质G（批 次20181025，96.8%）；盐酸伐地那非原料（批次20190501、20190502、20190503），以上对照品及供试品均来源于合肥创新医药技术有限公司。除乙腈、三乙胺为色谱纯、水为超纯水外，其他均为分析纯。

2 实验方法

2.1 溶液的制备

混合杂质对照品溶液：精密称取杂质A、B、C、D、E、F、G各约5 mg，置同一50 mL容量瓶中，加乙腈适量振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合杂质对照品贮备液；精密量取0.3 mL置100 mL量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液：取盐酸伐地那非原料适量，精密称取20 mg，置100 mL量瓶中，加流动相A适量振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。1%对照溶液：精密量取上述供试品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，即得。

系统适用性溶液：精密称取盐酸伐地那非对照品约20 mg，置100 mL量瓶中，再精密量取杂质对照品贮备溶液0.3mL，置同一100 mL量瓶中，加流动相A适量振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2 色谱条件及系统适用性

流动相A：0.5%三乙胺溶液（用磷酸调节pH至3.0）-乙腈（90∶10），流动相B：0.5%三乙胺溶液（用磷酸调节pH至3.0）-乙腈（10：90），Agilent C柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；柱温40℃；检测波长242 nm；流速1.0 mL/min；进样量20μL；采用梯度洗脱，洗脱条件见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件

精密称取杂质A、B、C、D、E、F、G适量，分别制备各杂质的对照品溶液，精密量取20μL，注入液相色谱仪，进行定位，再进注系统适用性溶液进行液相色谱分析。见图2，3。

图2 各杂质定位色谱图

系统适用性溶液中各已知杂质峰之间及与主成分峰与相邻杂质峰之间的分离度均符合要求（≥1.5）。

图3 系统适用性实验色谱图

3 实验结果

3.1 专属性

精密称取盐酸伐地那非原料约20 mg，6份，分别置100 mL量瓶中，其中1份作为破坏对照，另外5份分别进行60℃高温破坏10 d、光照（4 500±500）lx破坏10 d、3%过氧化氢溶液（1 mL）破坏4 h、1 mol/L盐酸溶液（1 mL）60℃水浴破坏8 h、1 mol/L氢氧化钠溶液（1 mL）60℃水浴破坏8 h，酸、碱破坏结束时分别加等量的碱、酸进行中和，再用流动相A适量振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀。按“2.2”项下色谱条件进样分析。结果表明，本品在高温、光照、酸、碱破坏条件下较稳定，仅产生少量的降解杂质；氧化破坏条件下不稳定，能产生明显的降解杂质。高温、光照、酸、碱、氧化破坏色谱图显示，本品主成分峰与相邻杂质峰之间分离度良好（≥1.5），主成分峰纯度因子符合要求，破坏前后物料基本守恒。

3.2 定量限、检测限、线性范围与校正因子

精密量取“2.1”项下的混合杂质对照品贮备液，加流动相A稀释制成0.04～1.00μg/mL浓度范围的一系列混合对照品溶液，精密量取20μL，注入色谱仪，记录色谱图。以各成分的浓度（μg/mL）为横坐标（

X

），峰面积为纵坐标（

Y

），进行线性回归，并以回归方程的斜率计算各已知杂质相对于盐酸伐地那非的校正因子（RCF），同时测定各成分的定量限与检测限，结果见表2。

表2 盐酸伐地那非有关物质线性和校正因子

3.3 重复性

取盐酸伐地那非原料约20 mg，精密称定，6份，按“2.1”项下供试品溶液制备方法制备，在“2.2”色谱条件下进行测定，以外标法计算已知杂质的含量，主成分自身对照法计算未知杂质的含量，结果单杂含量（≥0.05%）的RSD均＜10%（

n

=6），总杂含量的RSD均＜5%（

n

=6）。

3.4 中间精密度

由另一人，取盐酸伐地那非原料约20 mg，精密称定，6份，按“2.1”项下供试品溶液制备方法制备，换另一台液相色谱仪，在“2.2”色谱条件下进行测定，以外标法计算已知杂质的含量，主成分自身对照法计算未知杂质的含量，结果单杂含量（≥0.05%）的RSD均＜15%（

n

=12），总杂含量的RSD均＜10%（

n

=12）。

3.5 准确度

精密称取盐酸伐地那非原料约20 mg，9份，每3份分别精密加入2.1项下的混合杂质对照品贮备液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL，按“2.1”项下供试品溶液制备方法制成低、中、高浓度的加样供试品溶液，精密量取20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算各已知杂质的回收率，杂质A、B、C、D、E、F、G的 平 均 回 收 率 分 别 为99.8%、101.6%、102.4%、99.5%、100.5%、101.7%、103.6%，在99.5%～103.6%范围内，RSD分别为1.8%、0.6%、1.2%、1.4%、0.9%、1.5%、0.9%，均＜2%。

3.6 溶液稳定性

按“2.1”项下制备混合杂质对照品溶液与供试品溶液，25℃放置，分别于0、2、4、8、12、24、48h精密量取20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，实验结果表明：混合杂质对照品溶液各测定时间点的单个杂质峰面积与0 h比较，其相对平均偏差均小于2%；供试品溶液各测定时间点的单个杂质峰面积与0 h比较，大于0.05%的单个杂质峰面积的相对平均偏差均小于5%，且无新的降解杂质产生。

3.7 耐用性

分别调整柱温（40±2）℃、检测波长（242±2）nm、流速（1.0±0.05）mL/min及pH（3.0±0.2），同时更换不同品牌的色谱柱，考察色谱条件参数的变化对系统适用性溶液中杂质与主成分之间分离度的影响。实验结果表明，柱温、波长、流速及pH、不同品牌的色谱柱等参数的变化对系统适用性测定结果无影响，即盐酸伐地那非和杂质A、B、C、D、E、F、G 7个已知杂质的分离度均符合要求（≥1.5），方法的耐用性良好。

3.8 样品测定

按2.2项下的色谱条件及方法，对3批盐酸伐地那非原料进行有关物质测定，以外标法计算已知杂质的含量，主成分自身对照法计算未知杂质的含量，结果见表3。

表3 盐酸伐地那非有关物质检测结果/%

4 讨论

进口药品注册标准JX20030240中收载了3个已知杂质，分别为硫代二嗪酮酸、N-氧化物（Bay40-7424）、代谢物-1（Bay44-5576）。本研究在进口药品注册标准JX20030240的基础上，结合盐酸伐地那非的合成工艺路线，增加了中间体、反应副产物等工艺杂质的定量研究。另外，进口药品注册标准JX20030240中流动相体系为醋酸铵缓冲液-乙腈，其缓冲盐浓度较高，盐酸伐地那非主峰与杂质A分离度未达到1.5；为了改善杂质与杂质、杂质与主成分峰之间的分离度，本实验采用常规的C18柱（l=0.25 m，Φ=4.6 mm）、乙腈-磷酸三乙胺缓冲液体系，进行色谱条件的筛选优化，最终确定梯度洗脱色谱条件，结果各杂质峰及主成分峰的峰形良好（拖尾因子均在0.8～1.2之间），分离度均符合要求（≥1.5），色谱条件的耐用性良好，方法准确、灵敏、精密度良好，可作为盐酸伐地那非原料药有关物质的检测方法。