促性腺激素释放激素拮抗剂对顺铂化疗中小鼠卵巢的保护作用

熊露，胡雅君，李金丽，刘莉

随着放化疗等抗癌手段的进展，恶性肿瘤病人的生存率得到显著提高。但研究发现高剂量化疗药物应用在控制肿瘤生长、延续病人生命的同时，会出现多种副反应，严重病人还可发生生殖功能障碍，造成卵巢功能减退甚至衰竭。流行病学研究提示约70%左右病人经抗肿瘤治疗后存在不孕和卵巢功能减退或衰竭的临床症状，严重降低了女性病人生活质量。

促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）激动剂能够刺激相关性腺激素短时间内快速升高，能够即可抑制促性腺激素水平，更有利于人类生殖内分泌轴的可逆性控制。文献提示GnRH拮抗剂能够减少激动剂1～2周的等待期，进而抑制垂体-性腺轴相关功能，但GnRH也可能存在骨矿物质密度下降、热潮红等副反应，相关研究资料也较为缺乏。故而，本研究深入探讨了GnRH拮抗剂对化疗中小鼠卵巢的保护作用，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物和药物

2018年10月至2019年10月，选取华中科技大学同济医学院动物中心购置的5～6周龄SPF级BALB/c雌性小鼠30只，体质量范围15～20 g，购自湖北省动物实验中心，自由摄食和饮水，光暗12 h交替，室温范围20～25℃，相对湿度范围50%～65%。将小鼠随机数字表法分为A组、B组和C组，每组10只；顺铂和西曲瑞克均购于法国拜耳医药公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组方法及给药

选取BALB/c雌性小鼠30只，饲养1周左右后随机分为A组、B组和C组，A组腹腔注射等量生理盐水（20 mg/kg），B组腹腔注射顺铂（20 mg/kg），C组腹腔注射顺铂（20 mg/kg）和GnRH拮抗剂-西曲瑞克（5 mg/kg），均于小鼠的2个性周期的第10天。每组研究进行了3次的重复试验，每组小鼠数目10只，

1.2.2 血清测定

所有小鼠眼球取血后，3 000 r/min离心取血清，放射免疫法检测血清促卵泡生成素（FSH）、黄体生成素（LH）和雌二醇（E2）水平。

1.2.3 卵巢组织观察

取小鼠适量卵巢组织涂片，HE染色：梯度酒精脱水、苏木素-伊红染色，晾干、树胶封片，高倍显微镜下观察组织结构情况。原始卵泡，一个卵母细胞被覆部分或单层梭形前颗粒细胞；初级卵泡，一个卵母细胞被覆单层柱状颗粒细胞，卵母细胞与颗粒细胞间形成透；成熟卵泡，一个卵母细胞被覆多层的柱状的颗粒细胞，出现卵泡腔卵泡体积显著增大，卵泡腔增大，出现明显的卵丘，卵泡向卵巢表面突出，卵母细胞周同出现放射冠。将每只小鼠双侧卵巢计数的各级卵泡数分别相加再乘10，即为小鼠各级卵泡的总数。

1.2.4 Western blot检测

取所有小鼠适量卵巢组织，总蛋白使用组织匀浆法提取；取50μg总蛋白经SDS-PAGE裂解后转膜，牛血清蛋白（30 g/L）2 h封闭、分别加入兔抗鼠凋亡基因（Bax）及凋亡调控基因（Bcl-2）一抗，4℃孵育后加入辣根化的免疫球蛋白G（IgG）二抗，孵育后曝光显影。Western blot检测定量软件使用image J软件。

2 结果

2.1 各组小鼠卵巢湿重比较

各组小鼠卵巢湿重B组（8.95±0.91）和C组（15.17±0.88）卵巢湿重明显低于A组（18.04±0.82）（

P

＜0.05）；三组比较，差异有统计学意义（

F

=284.745，

P

=0.000）；各组两两比较，均差异有统计学意义（

P

＜0.05）

2.2 各组小鼠各级卵泡数量比较

B组和C组原始卵泡、生长卵泡和成熟卵泡明显低于A组（

P

＜0.05），其中C组原始卵泡、生长卵泡和成熟卵泡明显高于B组（

P

＜0.05），见表1。

表1 BALB/c雌性小鼠30只各级卵泡数量比较/（个，±s）

2.3 各组小鼠卵巢组织HE染色

与A组比较，B组生长卵泡及成熟卵泡明显减少，颗粒细胞排列紊乱，卵母细胞形态畸形，黄体细胞结构模糊，细胞核固缩，而C组有所改善。见图1。

图1 各组卵巢组织染色图（HE×400）：A为A组；B为B组；C为C组

2.4 各组小鼠血清FSH、LH和E水平

B组和C组FSH和LH明显高于A组（

P

＜0.05），而E、抗苗勒管激素（AMH）和基础抑制数B（INHB）明显低于A组（

P

＜0.05），其中C组FSH和LH明显低于B组（

P

＜0.05），而E、AMH和INHB明显高于B组（

P

＜0.05）。见表2。

表2 BALB/c雌性小鼠30只血清FSH、LH和E2水平比较/±s

2.5 各组卵巢组织Bax、Bcl-2蛋白表达

B组和C组Bcl-2蛋白相对表达量明显低于A组（

P

＜0.05），而Bax蛋白相对表达量明显高于A组（

P

＜0.05），其中C组Bcl-2蛋白相对表达量明显低于B组（

P

＜0.05），而Bax蛋白相对表达量明显低于B组（

P

＜0.05）。见表3和图2。

图2 各组卵巢组织Bax、Bcl-2蛋白表达（Western blot检测图）

表3 BALB/c雌性小鼠30只卵巢组织Bax、Bcl-2蛋白表达/±s

3 讨论

化疗是抗肿瘤治疗常用方法之一，但文献提示化疗在抑制病情进展，延长病人生存时间的同时还可损伤卵母细胞和颗粒细胞的功能及结构，表现出月经不调、不孕、骨质疏松、盗汗、心血管及泌尿系统功能障碍症状，进而严重降低病人生活质量。因而，化疗过程中探寻保护卵巢功能、减少卵巢损害的方法具有一定必要性。

文献提示GnRH激动剂能够抑制女性性腺轴，降低化疗药损伤原始卵泡，进而保护卵巢。但是GnRH激动剂仅对垂体兴奋作用较为短暂，因而在化疗过程中保护卵巢功能的作用受到了一定限制。部分学者提出GnRH能够结合垂体GnRH受体，进而对卵巢功能进行快速抑制，并有相关研究已经证实，GhRH拮抗剂抑制垂体促性腺激素释放激素受体和促性腺激素的作用显著优于GnRH激动剂，但具体作用效果和机制尚不明晰。

卵巢体质量尽管无法对卵巢功能进行直接、准确反映，但其与卵泡数量相关，卵巢体质量的下降预示着卵巢可能受到顺铂损伤，进而出现纤维化失重。本研究各组小鼠卵巢湿重比较结果显示B组和C组卵巢湿重明显低于A组，其中C组卵巢湿重明显高于B组。该结果说明GnRH拮抗剂能在降低顺铂对卵巢造成的纤维化损伤，进而保护卵巢。

研究发现卵泡对化疗药物具有较高敏感性，随着化疗时间推移，卵泡自然凋亡后卵泡的丢失数量升高，进而使女性出现卵巢早衰的症状。本研究各组小鼠各级卵泡数量结果显示B组和C组原始卵泡、生长卵泡和成熟卵泡明显低于A组，其中C组原始卵泡、生长卵泡和成熟卵泡明显高于B组；与A组比较，B组生长卵泡及成熟卵泡明显减少，颗粒细胞排列紊乱，卵母细胞形态畸形，黄体细胞结构模糊，细胞核固缩，而C组有所改善。该结果说明GnRH拮抗剂可降低顺铂对小鼠卵泡的损伤，其可能是通过抑制雌激素的分泌进而起到治疗作用。

FSH是由垂体前叶嗜碱性细胞分泌，即卵泡刺激素，对人体的发育、生长以及生殖等生理过程均具有调控作用，进而促进生殖细胞的成熟；LH亦称促间质细胞激素，对作用于卵胞，而促进排卵并生成黄体；E主要由黄体、卵巢滤泡及妊娠时胎盘生成。本研究激素水平结果显示B组和C组FSH和LH明显高于A组，而EAMH和INHB明显低于A组，其中C组FSH和LH明显低于B组，而EAMH和INHB明显高于B组。上述结果说明GnRH拮抗剂能够抑制垂体-性腺轴相关功能并促进卵巢激素的分泌，证实GnRH拮抗剂具有改善卵巢储备功能的作用。

Bax、Bcl-2是常见凋亡蛋白，能够预示细胞凋亡情况。本研究中B组和C组Bcl-2蛋白相对表达量明显低于A组，而Bax蛋白相对表达量明显高于A组，其中C组Bcl-2蛋白相对表达量明显低于B组，而Bax蛋白相对表达量明显低于B组。该结果说明GnRH拮抗剂能够抑制化疗药物对卵巢正常细胞的凋亡作用，进而保护小鼠卵巢，最大限度降低顺铂对小鼠卵巢的损害。在效应方面，Bcl-2为保护因素，Bax过表达可拮抗前者的保护效应，本研究发现C组Bax蛋白相对表达量低于B组，说明C组的细胞凋亡具有更强的保护效应。

综上所述，GnRH拮抗剂可降低顺铂对小鼠卵巢的损害，保护小鼠卵巢储备功能。